Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

1. Aislamiento de complejos de proteínas nativas por bandera purificación por afinidad Preparativos Establecer un baño de agua C 37 ° para descongelar el sedimento celular. Enfriar una microcentrífuga a 4 ° C. Coloque varios tubos de microcentrífuga de diferentes tamaños (1,5 ml, 15 ml) y un homogeneizador en hielo. Preparar 10 ml de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 150 mM, 0,1% Nonidet P-40, 1 mM EDTA) y mantenerse en hielo. Justo antes de usar el tampón, añadir 10 l de DTT 1 M y una tableta triturada de inhibidores de proteasa libre de EDTA. Preparación de perlas de anticuerpo ligado NOTA: Las perlas recubiertas de anticuerpos se pueden preparar hasta una semana de antelación y guardar en la nevera hasta que se necesite. Proteína G tiene mayor afinidad que la proteína A para la mayoría de las especies de inmunoglobulina subtipos, a excepción de IgG de conejo, para los que la proteína A tiene una afinidad más alta. Lavar 50 l de perlas magnéticas recubiertas con Proteína G: Transferencia 50 y# 956; L de suspensión de perlas a un tubo de microcentrífuga, se coloca el tubo en el imán para recoger las perlas en el lado del tubo y eliminar el líquido. Resuspender las perlas en 0,5 ml de PBS-0,01% de Tween-20. Colocar el tubo en el imán para recoger las perlas en el lado del tubo y eliminar el líquido. Resuspender las perlas en 40! L de PBS-0,01% de Tween-20. Añadir 10 g (10! L de 1 mg / ml de solución madre) de anticuerpo anti-FLAG M2. Incubar con rotación durante 20 min a temperatura ambiente. Colocar el tubo en el imán para recoger las perlas en el lado del tubo y eliminar el líquido. Lavar las perlas con 0,5 ml de PBS-0,01% de Tween-20. Para la reticulación del anticuerpo a las perlas, lavar las perlas dos veces con 1 ml de 0,2 M trietanolamina pH 8,2. Entonces, resuspender las perlas en 1 ml de DMP 20 mM (pimelimidato de dimetilo) en M trietanolamina pH 8,2 0,2 ​​(solución DMP debe estar preparado fresco inmediatamente antes de su uso). Incubar con rotación a temperatura ambiente durante 30 min. </li> Se coloca el tubo en el imán. Eliminar el sobrenadante y resuspender las perlas en 0,5 ml de Tris-HCl 50 pH 7,5. Incubar con rotación a temperatura ambiente durante 15 min. Lavar las perlas 3 veces con 0,5 ml de PBS-0,1% de Tween-20. Deja cuentas en el último lavado hasta que se necesite. purificación por afinidad basada en FLAG NOTA: Tenga cuidado de no dejar los talones sin necesidad de búfer durante un largo periodo de tiempo. Todos los tampones y los tubos deben mantenerse en hielo en todo momento. El siguiente protocolo se ha optimizado para la purificación de complejos de proteínas de 2-5 x 10 8 células (10-20 mg de proteína de lisado) que expresa niveles endógenos de una proteína marcada con FLAG 20. Descongelar el pellet de células en un baño de agua a 37 ° C hasta que empieza a derretirse. Tome el tubo fuera de la bañera, se agita suavemente hasta que el sedimento se descongeló completamente, e inmediatamente colocar el tubo que contiene la suspensión de células en hielo. Añadir 5 ml de tampón de lisis enfriado en hielo(Que contenía DTT e inhibidores de proteasa) a la suspensión de células y agitar para mezclar. Incubar en hielo durante 10 min. Transferir el lisado a un homogeneizador Dounce frío. Lisan con 20-30 golpes utilizando la mano del mortero apretado (hasta que no haya viscosidad apreciable). Transferir el homogeneizado a tubos de microcentrífuga fríos. Centrifugar a 18.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Transferir el lisado aclarado a un tubo frío limpio. Deja 50 l de lisado atrás. Tomar una parte alícuota de 35 l de lisado para medir la concentración de proteína y monitorear la purificación. Retire el PBS-0,1% de Tween-20 a partir de las perlas. Resuspender las perlas con 1 ml de lisado y mezclar con el resto del lisado. Incubar la mezcla en una rueda giratoria a 4 ° C durante 1-2 h. Recoger las perlas en el lado del tubo con el imán. Se recoge una alícuota de 30! L de sobrenadante y desechar el resto del sobrenadante. Resuspender las perlas en 0,5 ml de IPP150 tampón (mM Tris-HCl 10 pH 8, 15NaCl 0 mM, 1 mM de EDTA, 0,1% NP-40) pipeteando 4-6 veces. Transferir a un tubo frío de 1,5 ml. Repetir los lavados con 0,5 ml de tampón IPP150 dos veces más. Lavado de perlas de tres veces con 0,5 ml de tampón de elución nativo FLAG (20 mM Bis-Tris pH 7, NaCl 20 mM, 0,02% de Nonidet P-40, EDTA 1 mM, ácido 200 mM ε-aminocaproico). Con el último lavado, la transferencia de las perlas a un nuevo tubo frío. Eliminar el tampón a fondo. Resuspender las perlas en 100! L de 200 mg / péptido FLAG ml 3x en tampón de elución nativo. Se incuba a 4 ° C durante 10 minutos con rotación suave. Recoger las perlas con el imán y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo frío. Repita los pasos 1.3.10-1.3.11 dos veces. En común todos los eluidos. Se concentra el eluato hasta 25 l en una unidad de filtro centrífugo (10 kDa límite de peso molecular nominal de corte, PES) por centrifugación a 10.000 xg a 4 ° C. Transferir el eluato se concentró a un nuevo tubo frío y añadir 50% glycerol para una concentración final de 5%. El eluato se concentró puede mantenerse a 4 ° C durante la noche si es necesario. 2. Azul nativo PÁGINA Preparativos Preparar 1 litro de 1x PAGE natural ánodo Buffer, 1x PAGE natural oscuro Azul cátodo y búfer 1x PAGE natural Light Blue Buffer cátodo. Retire el peine de un gel PAGE nativa prefabricado 3-12% y lavar los pocillos dos veces con 1x PAGE nativa oscuro Azul Cátodo Buffer. Llenar los pocillos con 1x PAGE natural oscuro Azul cátodo Buffer. Configurar el gel en el tanque en funcionamiento pero no agregue azul oscuro cátodo Buffer al cátodo cámara (en el interior). corrida electroforética Preparar la muestra: Para los 25 l concentrados eluato añadir volumen apropiado de tampón de carga de muestra nativo 4x y de 0,5% G-250 aditivo muestra para concentraciones finales de 1x y 0,005%, respectivamente. Cargar la muestra y los marcadores de peso molecular nativas dejando un pozo vacío between ellos. Carga 10-20 l de tampón de carga de muestra 1x nativa en todos los pocillos vacíos. Llenar la cámara catódica (en el interior) con 200 ml de 1x PAGE natural oscuro Azul cátodo Buffer con cuidado para no molestar a las muestras. Llenar la cámara de ánodo (exterior) con 550 ml de 1x PAGE nativa Ánodo Buffer. Ejecutar el gel a 150 V durante 30 min. Detener la ejecución, eliminar el azul oscuro del cátodo Buffer con una pipeta serológica y reemplazar con 1x Buffer luz azul cátodo. Continuar la carrera por 60 min. El gel se puede ejecutar a temperatura ambiente o a 4 ° C; la temperatura puede tener un efecto sobre la estructura compleja de proteínas. tinción de gel Abra la casete de gel y descartar una de las placas de cassette. El gel permanece unida a la otra placa de cassette. Transferir el gel en una bandeja o receptáculo que contiene suficiente solución de fijación (metanol al 40%, 2% de ácido acético) para cubrir el gel y se incuba durante 30 min con agitación suave. Retire el fijador solutiones y añadir agua suficiente para cubrir el gel. El gel se puede escanear para referencia futura. Análisis 3. Espectrometría de Masas Nota: Todas las etapas posteriores se deben realizar en una campana de flujo laminar, si es posible para asegurar la limpieza de las muestras. Todas las soluciones deben ser preparados con agua de grado HPLC. Discutir este protocolo con el laboratorio de espectrometría de masas que llevará a cabo el análisis. Preparativos Colocar una placa de 96 pocillos de fondo cónico en la parte superior de otra placa de 96 pocillos para recoger los residuos. Pierce la parte inferior de los pocillos de la placa de 96 pocillos de fondo cónico con una aguja 21 G. Lavar los pocillos de la placa de 96 pocillos perforado. Añadir 200! L de ácido fórmico al 50% de acetonitrilo-0,25% a los pocillos de la placa perforada. Incubar la pila de placas en un agitador durante 10 min. Centrifugar a 500 xg durante 1 min para que el líquido fluye a través de los agujeros en la placa de recogida de residuos. Desechar el wlíquido aste. Repita los pasos 3.1.2.1-3.1.2.2 dos veces más. Rellena los pocillos de la placa de 96 pocillos perforado con 150 l de bicarbonato de amonio 50 mM (recién hecho). Lavar los pocillos de una filtración centrífuga placa de 96 pocillos. Colocar una placa normal de 96 pocillos debajo de la placa de filtración centrífuga para recoger los residuos. Añadir 200! L de ácido fórmico al 50% de acetonitrilo-0,25% a cada pocillo de la placa de filtración centrífuga. Centrifugar la pila de placas a 200 xg durante 1 min. Desechar los residuos. Repita los pasos 3.1.3.1-3.1.3.2 dos veces más. la escisión en gel y en la digestión-gel NOTA: Mientras ablación del gel, identificar y hacer una nota de la sección de gel alineados a cada uno de los patrones de proteínas. Los patrones de proteína se pueden utilizar para estimar los pesos moleculares aproximados para todos los cortes de gel. Colocar el gel con la placa de vidrio sobre una superficie limpia. Cortar el carril contieneing la muestra en 48 rodajas idénticas (1,5 mm x 5 mm). Cortar cada rebanada en 2-3 trozos más pequeños (excepto los últimos cinco rebanadas en la parte superior del gel) y colocar cada rebanada secuencialmente en un pocillo de la perforado y se lavó la placa de 96 pocillos. Añadir 50 l de acetonitrilo a cada pocillo. Se incuba la placa con agitación durante 30-60 min. Retirar el líquido por centrifugación como en el paso 3.1.2.2. Añadir 200! L de TCEP 2 mM en bicarbonato de amonio 50 mM a cada pocillo. Se incuba la placa con agitación durante 30 min a temperatura ambiente. Retirar el líquido por centrifugación como en el paso 3.1.2.2. Añadir 200! L de 4 mM yodoacetamida en 50 mM de bicarbonato de amonio a cada pocillo. Se incuba la placa con agitación durante 30 min a 37 ° C en la oscuridad. Retirar el líquido por centrifugación como en el paso 3.1.2.2. Añadir 150! L de bicarbonato de amonio 50 mM más 50 l de acetonitrilo y se incuba la placa con agitación durante 30 min a temperatura ambiente. Repita este paso de lavado unas muchas veces como sea necesario hasta que todo el color azul se retira de las piezas de gel. Deshidratar las piezas de gel mediante la adición de 200 l de acetonitrilo puro y se incuba con agitación a temperatura ambiente durante 20 min hasta que las piezas de gel son de color blanco y opaco. Eliminar el acetonitrilo. Añadir 150! L de 0,001 mg / ml de tripsina (grado de secuenciación) en bicarbonato de amonio 50 mM frío a cada pocillo. Se incuba la placa con agitación a 37 ° C durante 2 h. Después de 1 h, comprobar que las piezas de gel se cubren con el líquido; si este no es el caso, añadir otro 50-100 l de bicarbonato de amonio 50 mM. Después de 2 h a 37 ° C, continuar la digestión a 25 ° C durante la noche. Colocar una placa de fondo cónico limpia debajo de la placa que contiene el gel, lo que garantiza la correcta orientación de las placas. Recoger el líquido que contiene los péptidos por centrifugación a 200 xg durante 1 min. Coloque la placa de péptidos que contienen en un evaporador de centrífuga y se evapora el líquido mientras se realizaba tque el próximo paso. Añadir 150! L de ácido fórmico al 50% de acetonitrilo-0,25% a las piezas de gel. Incubar con agitación a 37 ° C durante 30 min. Recoger el líquido en la placa parcialmente seco de la etapa 3.2.9 por centrifugación a 200 xg durante 1 min. Continuar la evaporación de la placa de péptidos que contienen durante la realización de la siguiente etapa. Repita los pasos 3.2.10-3.2.11. Añadir 200? L de acetonitrilo puro a cada pocillo de la placa que contiene las piezas de gel. Incubar con agitación a temperatura ambiente durante 15 min. Recoger el líquido en la placa de péptidos que contienen por centrifugación a 200 xg durante 1 min. Asegúrese de que la concentración final de acetonitrilo en todos los pozos es superior al 55%. Si es necesario, añadir acetonitrilo puro extra. Transferencia de las soluciones de péptidos a la placa de filtración centrífuga se lavó. Colocar una placa de fondo cónico limpia por debajo de ella para recoger los péptidos. Centrifugar la pila de placas a 200 xg durante 1 min. evaporcomió el líquido en la placa de fondo cónico hasta que los pozos estén completamente secas. La placa puede ser cubierto con una tapa de silicona y se almacenó a -20 ° C en esta etapa. Re-disolver péptidos en 32 l de ácido fórmico al 0,5% con agitación vigorosa durante 15 min. Añadir 8 l de bicarbonato de amonio 400 mM y se incuba con agitación vigorosa durante 15 min. Centrifugar la placa a 200 xg durante 1 min. Cubrir con una tapa de silicona y almacenar la placa a -20 ° C hasta que el análisis de espectrometría de masas. Espectrometría de masas NOTA: Analizar los péptidos en un espectrómetro de masas de alta resolución utilizando métodos compatibles con la proteómica escopeta. adquisición dependiente de datos es el LC-tándem más utilizada MS puesta a punto para este tipo de análisis y debe ser optimizada para la identificación de péptidos eficiente, minimizando secuenciación redundante y selección de candidatos sobre el ruido de fondo. Los espectros de masas en la exploración análisis de masas primera etapa (MS1) debe ser registrada en el modo de perfil. Es recomiendaed para seleccionar preferentemente iones con carga doble y triplemente para análisis de masas etapa segunda (MS2). Un rango de masas de m / z 400-1,600 es adecuado para identificar la mayoría de los péptidos entre 8-30 gama aminoácidos. Aquí, se proporciona un protocolo para el análisis utilizando un espectrómetro de masas Orbitrap. Inyectar 20 l de muestra por análisis utilizando el muestreador automático de un sistema de nanoLC-MS / MS. Desalar y concentrar los péptidos en una columna de fase inversa C18 (100 m Identificación, 2 cm). péptidos separados sobre una columna C18 analítica (75 micras ID, 15 cm) utilizando un gradiente lineal de 30 min de ácido fórmico 4-28% de acetonitrilo / 0,1% a 300 nL / min. Analizar los péptidos en un espectrómetro de masas con un método de adquisición 10 depende de los datos de arriba con los siguientes parámetros: m / z gama 380-1,600, resolución de 30.000 a m / z 400, ancho de aislamiento de 2 Th, la exclusión dinámica a ± 10 ppm durante 45 s , objetivo de control automático de ganancia a 1 x 10 6 para MS y 5000 para MS / MS, el tiempo de inyección máxima de 150 ms para la EM y100 ms para MS / MS. Análisis 4. Datos Identificación de proteínas y cuantificación usando MaxQuant Utilice el software MaxQuant libremente disponibles para identificar y cuantificar las proteínas en cada fracción de gel a partir de los datos en bruto de espectrometría de masas. NOTA: MaxQuant trabaja en los datos generados por la proteómica enfoques escopeta de adquisición de datos dependiente. Los datos de EM de la Blue fracciones gel nativo deben ser analizados en lote como experimentos separados y no como fracciones de un experimento que combina todos los cortes de gel. Marque la casilla valor iBAQ para realizar cálculos estequiométricos. Los protocolos detallados para la búsqueda de base de datos y la proteína cuantificación usando MaxQuant se describen en 21, 22. Análisis del perfil de proteína usando Perseo Utilice el software de libre disposición Perseo para mostrar los perfiles de migración de las proteínas identificadas y compararlas utilizandoanálisis estadístico. NOTA: Documentación general sobre el uso de Perseo está disponible en http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:tutorials. Una muestra de datos está disponible como datos complementarios. Subir el archivo proteingroups.txt devuelto por el análisis MaxQuant que contiene las identificaciones de proteína y los valores de cuantificación para todas las fracciones de gel. Rellenar los valores de intensidad en la caja principal (Figura 1). Aparecerá una matriz que contiene todas las identificaciones de proteína en filas, con las fracciones de gel como columnas. Eliminar entradas correspondientes a los accesos inversa, proteínas únicamente se han identificado por sitio y posibles contaminantes mediante la selección de filas filtro basado en la columna categórica en el menú desplegable filas de filtro (Figura 2). Normalizar las intensidades fracción de cada proteína a través del perfil frente a la intensidad total de proteínas mediante la selección de Divide en el menú desplegable Normalizar, entonces Sum (Figura 3). Un nuevo maparece Atrix. Visualizar las parcelas perfil de migración de todas las proteínas mediante la selección de perfil Parcela en el menú de visualización desplegable (Figura 4). Seleccionar filas filtro basado en valores válidos en el menú desplegable filas filtro. Introduzca 1 en el número de valores válidos requeridos. Realizar agrupación jerárquica de las proteínas identificadas a través de todas las fracciones de gel nativos azules seleccionando agrupación jerárquica en el menú desplegable Clustering / PCA. Desactive la casilla Columnas árbol (Figura 5). Los racimos se visualizan en un mapa de calor en la pestaña Clustering al lado de la matriz (Figura 6). Busque el clúster que contiene la proteína de cebo en el dendrograma. Otros componentes de la agrupación representan proteínas co-migran con el cebo y, por tanto, son posibles proteínas que interactúan / subunidades del mismo complejo. <b r /> Figura 1. Captura de Perseo ventana de carga de datos. La figura muestra las etapas para la carga de la identificación de proteínas y datos de cuantificación en Perseo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2. Captura de pantalla de ventana de Perseus para el filtrado de las entradas correspondientes a los contaminantes, los accesos y las proteínas identificadas por sitio revertir. Selección de filas de filtro de columna categórica abre una nueva ventana para seleccionar los tipos de entradas de proteínas a ser eliminado del conjunto de datos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. /55498fig3.jpg"/> Figura 3. Imagen de pantalla de ventana normalización Perseo. Divide la selección en el menú de Normalización abre una nueva ventana, con diferentes opciones. Selección de Sum divide el valor de intensidad de una proteína en cada fracción por la intensidad total de esa proteína a través de todas las fracciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4. Captura de Perseus que muestra gráficos de perfil de migración. Las proteínas se pueden seleccionar en la matriz por debajo de los perfiles para resaltar su perfil correspondiente. La barra de herramientas se puede utilizar para editar y exportar los perfiles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = "siempre"> Figura 5. Imagen de Perseo ventana agrupación jerárquica. La figura muestra la configuración de la agrupación jerárquica de proteínas usando Manhattan (L1) distancia métrica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6. Imagen de pantalla de Perseus que muestra dendrograma y las intensidades de proteínas heatmap. El flujo de trabajo en el lado derecho del panel principal muestra cada paso llevado a cabo y la matriz resultante, y se puede utilizar para deshacer cualquier paso. El flujo de trabajo también puede bifurcarse de cualquier matriz intermedia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Cálculo de la estequiometría relativa Seleccionar las subunidades de un complejo de proteínas en función de su co-agrupación con la proteína cebo y delimitar el pico (s) perfil en el que aparecen. Utilice los valores iBAQ devueltos por análisis MaxQuant para cada subunidad en cada fracción por separado y normalizar por el valor iBAQ cebo correspondiente en esa fracción. Representar gráficamente los iBAQs normalizados para el cebo y la proteína subunidades complejos a través de las fracciones de pico seleccionado y aplicar regresión lineal. Calcular la cantidad relativa de la subunidad complejo de cebo mediante la comparación de las tendencias de sus valores iBAQ normalizados. Estimación de proteína tamaño complejo Usa los estándares de proteína para calcular los pesos moleculares predichos de los azules alineación de cortes de gel nativas del carril de la muestra. De estos, generar un modelo de regresión lineal mediante el trazado de las porciones de gel en el eje x y pesos moleculares en el eje y. </li> Utilizar el modelo para estimar el rango de peso molecular observado de la proteína compleja (es), basado en la rebanada nativo azul (s) de la que fueron identificados.