حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط
Summary
هنا نقدم بروتوكولات لتنقية تقارب من المجمعات البروتين وفصلهم من قبل PAGE الأم الزرقاء، تليها البروتين ارتباط التنميط باستخدام التسمية مجانا الكمي مطياف الكتلة. هذه الطريقة مفيدة لحل interactomes إلى مجمعات البروتين متميزة.
Abstract
Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological processes. Affinity purification coupled to mass spectrometry (AP-MS) has become the method of choice for identifying protein-protein interactions. However, conventional AP-MS studies provide information on protein interactions, but the organizational information is lost. To address this issue, we developed a strategy to unravel the distinct functional assemblies a protein might be involved in, by resolving affinity-purified protein complexes prior to their characterization by mass spectrometry. Protein complexes isolated through affinity purification of a bait protein using an epitope tag and competitive elution are separated through blue native electrophoresis. Comparison of protein migration profiles through correlation profiling using quantitative mass spectrometry allows assignment of interacting proteins to distinct molecular entities. This method is able to resolve protein complexes of close molecular weights that might not be resolved by traditional chromatographic techniques such as gel filtration. With little more work than conventional AP-geLC-MS/MS, we demonstrate this strategy may in many cases be adequate for obtaining protein complex topological information concomitantly to identifying protein interactions.
Introduction
في الخلايا، فإن معظم البروتينات أداء مهامهم من خلال تفاعلات البروتين البروتين عابرة أو من خلال تشكيل مجالس البروتين مستقرة. تميز تفاعلات البروتين المهم لعمليات الخلوية فهم تماما. تنقية التقارب في تركيبة مع الطيف الكتلي (AP-MS) هي واحدة من الاستراتيجيات المطبقة الأكثر شيوعا لتحديد تفاعلات البروتين الأم. وقد أدخلت تحسينات كبيرة في قدرات الأدوات التي تحققت في العقد الماضي هذا النهج قوية للغاية. ومن المهم أن نلاحظ أن التفاعلات التي تم تحديدها من خلال التجارب AP-MS وتشمل خليطا من الجمعيات المباشرة وغير المباشرة بين الطعم ويفترس. وبالإضافة إلى ذلك، في كثير من الأحيان البروتينات تشارك في العديد من المجمعات المختلفة داخل نفس السياق الخلوية، والتي قد يكون لها دور البيولوجية المختلفة، وبالتالي فإن interactors التي يتم تحديدها من قبل AP-MS قد تمثل مزيجا من المجالس البروتين متميزة أو الكيانات الوظيفية. وليس من الممكن لاستخلاصهذه المعلومات الطوبوغرافية مسبقا من القوائم أحادية الأبعاد للبروتينات التي تولدها التجارب AP-MS بسيطة. ومع ذلك، فإن تقنية يمكن زيادة استغلالها لتحديد بنية البروتين المجمعات من خلال الجمع بين ذلك مع أساليب واحد أو أكثر لحل هذه التجمعات.
من أجل حل طوبولوجيا من التفاعلات البروتينية التي تم تحديدها من خلال AP-MS، وقد تم تطبيق عدة استراتيجيات. نهج واحد هو لأداء متكررة التجارب AP-MS باستخدام يفترس التي تم تحديدها في الجولة السابقة من التجارب كما الطعوم 1. وعلى الرغم من المفيد جدا، وهذا هو تماما مهمة كثيفة العمالة على حد سواء بالتجربة وتحليلي. ويتزايد استخدام البروتين عبر ربط بالاشتراك مع مطياف الكتلة لاستخلاص المعلومات الطوبوغرافية على بروتين المجمعات 2، 3، 4، 5. ومع ذلك، computatioتحليل نال من الببتيدات عبر ربط لا يزال مهمة صعبة، وبالتالي هو عنق الزجاجة في سير العمل. ظهور الكواشف ربط عبر MS-شطورة أن يسهل رسم الخرائط من بقايا الأحماض الأمينية التي هي على مقربة في التفاعل البروتينات 6 و 7. وثمة بديل آخر يتمثل في الجمع بين تنقية تقارب مع تقنيات الفصل المتعامدة السابقة 8 و 9. وأيضا في الآونة الأخيرة تم استخدام تجزئة الكروماتوغرافي عن طريق الترشيح هلام أو التبادل الأيوني، أو السكروز تجزئة التدرج في تركيبة مع الطيفي الكمي لوصف المجمعات multiprotein في مستوى المنظومة، من خلال تمرير العزلة خطوة معقدة 10، 11، 12، 13. الأزرق هلام بولي أكريلاميد الأصلي الكهربائي (BN-PAGE) تم تطبيق على نطاق واسعالتحقيق في التفاعلات البروتينية الأم، وعادة تلك التي تنطوي على مجمعات البروتين غشاء الميتوكوندريا 14. كما كانت تستخدم هذه التقنية الانفصال مؤخرا بالاشتراك مع التسمية خالية الكمي البروتين والتنميط الارتباط، ليس فقط على المجمعات الميتوكوندريا 15، 16، 17، ولكن أيضا للكشف بروتين المجمعات الأخرى من الخلايا الكاملة 18 و 19. افترضنا أن الجمع بين تنقية تقارب مع نهج تجزئة الأم اللاحقة وMS الكمي ينبغي أن توفر استراتيجية مفيدة للحل المجالس البروتين متعددة تحتوي على بروتين معين.
نحن هنا وصف الأسلوب الذي يجمع بين العامة على أساس حاتمة تنقية تقارب مع الأزرق الأصلي الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد من المجمعات معزولة، تليها س كتلة الكميectrometry والبروتين ارتباط التنميط، من أجل حل المجالس متعددة قد يكون متورطا بروتين في. نحن توظيف الماوس الجنينية الخلايا الجذعية حيث يتم التعبير عن بروتين من الفائدة تنصهر علامة حاتمة من موضع الذاتية لتحقيق مقربة من وفرة الفسيولوجية وضمان مواليد كفاءة العزلة معقدة. هذا النهج كشف النقاب عن التفاعلات متعددة بروتين يشارك في وحل لهم في مجالس مختلفة تعتمد على ملامح علاقة بهم، في حين لا تتطلب المزيد من العمل من التقليدية أنصار الكنيسة الألمانية-MS 20.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن تصف استخدام تنقية تقارب يليه الأزرق الكهربائي للهلام الأصلي في تركيبة مع مطياف الكتلة الكمي لحل مجمعات البروتين. ويوفر هذا النهج طريقة لكشف قوائم التفاعل البروتين ذات بعد واحد في المجالس البروتين وظيفية.
نحن لشرح طريقة تعتمد على استخدام البروتينات الموسومة حاتمة. ومع ذلك، إذا كان خط الخلية تعبر عن بروتين الموسومة غير متوفر، قد يكون بديلا لاستخدام أجسام مضادة ضد بروتين من الفائدة، شريطة وجود الببتيد المتاحة لتحقيق شطف تنافسية الأصلي. قد تحتاج إلى تعديل تبعا لمستوى التعبير عن بروتين الهدف كمية بدءا المادية وكمية من الخرز. ونحن أداء عادة هذا البروتوكول 2-5 × 10 8 خلايا بدءا المواد، وهذا يكفي حتى للبروتينات مع مستوى التعبير منخفضة. وينبغي اختيار تكوين العازلة تحلل تجريبيا لتحقيقبالقرب من إكمال الإذابة من الطعم. وهذا قد يكون صعبا بالنسبة لبعض أنواع البروتينات، وخاصة لونين ملزمة أو بروتينات الغشاء. وتشمل الخيارات البديلة زيادة كمية الملح، شريطة أن يكون بروتين معقد تحت الدراسة هو مستقر في الملح العالية، أو باستخدام صوتنة و / أو العلاج نوكلياز لونين البروتينات ملزمة 20 و 29. في حالة بروتينات الغشاء، والتحول إلى المنظفات DDM أو ديجيتونين قد يكون من المستحسن 30. في حالة DNA البروتينات ملزمة، فمن المفيد أن تشمل نوكلياز مثل benzonase خلال خطوة تنقية 20. إزالة كاملة من الأحماض النووية يضمن أن التفاعلات الكشف تحدث بين البروتينات ولم يتم بوساطة الحمض النووي.
وثمة عنصر حاسم في الاعتبار عند استخدام هذا النهج هو استقرار المجمع قيد التحقيق. هذا الإجراء هو طويل وقد تنطوي على لحفز البروتين بين عشية وضحاها معقدة. لقد حققنا نجاحا جيدا مع مجمعين لونين إعادة عرض (D. بوده وM. باردو، لا تظهر البيانات)، ولكن هذا يجب أن يتم تقييم. يمكن اختصارها الخطوة تنقية تقارب إذا لزم الأمر.
التقنيات البديلة التي تسمح للتجزئة الأم، مثل اللوني حجم الإقصاء، وقد استخدمت على نطاق واسع لأكثر من 50 عاما لتوصيف المجمعات البروتين. نحن وغيرنا قد أظهرت أن حل PAGE الأم الزرقاء متفوقة على أن تحقيق ذلك باستخدام حجم الإقصاء اللوني 20، 31، 32، 33. ميزة أخرى لPAGE الأم الزرقاء هو أنه لا يتطلب أنظمة اللوني، والتي هي مكلفة، وإنما يستخدم البروتين المعدات الكهربي التي هي على نطاق واسع في المختبرات. من حيث التدريب العملي في الوقت المحدد، وهذه الطريقة لا تنطوي على المزيد من العمل من أنصار الكنيسة الألمانية-MS / MS التقليدي لpproach أو غير متصل الكروماتوغرافي تجزئة. لكن، وكما تفعل معظم تقنيات تجزئة، ولها حدود لحلها. المجمعات التي هي متجانسة جدا أو قريبة في الكتلة والشكل قد يكون وراء قرار تقدمها PAGE الأم الزرقاء، وبالتالي البروتوكول كما ذكرت هنا قد لا تكون ناجحة عالميا في حل المجمعات متميزة مع مفارز مشتركة. ومن المشجع أن نكون قد وفقنا في فصل مجمعين رباعي القسيمات مشابهة جدا تقاسم ثلاثة مفارز (M. باردو، مخطوطة في الإعداد).
منذ مطياف الكتلة قد تصبح حساسة على نحو متزايد، حتى كميات ضئيلة من interactors والملوثات غير محددة يمكن اكتشافه في عينات AP-MS. النهج المقدمة هنا قد يساعد في التمييز interactors حقيقية من التلوث الخلفية في تنقية تقارب من خلال التركيز على الاهتمام على البروتينات مع وجود قمم الهجرة التي تتزامن مع قمم الطعم الهجرة على أعلى الوزن الجزيئي من ذلكالبروتينات أحادى.
وقد استخدمت العديد من المجموعات تقنيات تجزئة تليها البروتين ارتباط التنميط لتحديد بروتين المجمعات على نطاق واسع الخلوي دون الحاجة لعزل السابقة 10 و 11 و 12 و 34. ومع ذلك، فإن هذا يمكن أن يؤدي إلى الفشل في الكشف عن التفاعلات شبه متكافئة. إدراج خطوة التخصيب من خلال تنقية تقارب يمكن أن يساعد على التغلب على هذا. يجب أن يكون النهج الموصوف هنا من المفيد بشكل عام لاستكشاف طوبولوجيا المجمعات البروتين وكشف المجمعات متعددة بروتين معين يشارك في داخل نفس السياق الخلوية. استراتيجية بسيطة وقابلة للمختبرات التي قد لا تكون مكلفة المعدات تجزئة الكروماتوغرافي لحل مجمعات البروتين.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by the Wellcome Trust (WT098051).
Materials
| Protein G Dynabeads | Life Technologies | 10003D | |
| FLAG antibody M2 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| Tween-20, protein grade, 10% solution | Millipore | 655206 | |
| Dimethyl pimelimidate | Sigma-Aldrich | 80490 | |
| 0.2 M Triethanolamine buffer, pH 8.2 | Sigma-Aldrich | T0449 | |
| 3x FLAG peptide | Sigma-Aldrich | F4799 | |
| Vivaspin 5K NMWCO, PES | Sartorius | VS0112 | |
| NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel | Life Technologies | BN1001 | |
| 20x NativePAGE Running Buffer | Life Technologies | BN2001 | |
| 20x NativePAGE Cathode Additive | Life Technologies | BN2002 | |
| 4x NativePAGE sample loading buffer | Life Technologies | BN2003 | |
| NativeMARK | Life Technologies | LC0725 | |
| NativePAGE 5% G-250 sample additive | Life Technologies | BN2004 | |
| Nunc conical bottom 96-well plate, polypropylene | Thermo | 249944 | |
| Multiscreen HTS 96-well filtration system | Thermo | MSDVN6550 | |
| Nunc 96-well cap natural | Thermo | 276002 | |
| TCEP (Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I1149 | |
| Acetonitrile, HPLC grade | Fisher Scientific | A/0627/17 | |
| Trypsin, sequencing grade | Roche | 11418475001 | |
| Software | |||
| MaxQuant (software) | N.A. | N.A. | http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant |
| Perseus (software) | N.A. | N.A. | http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus |
References
- Goudreault, M., et al. A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein. Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).
- Leitner, A., et al. Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics. Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).
- Rappsilber, J. The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes. J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).
- Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions. Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).
- Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. Mass spectrometry supported determination of protein complex structure. Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).
- Kaake, R. M., et al. A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells. Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).
- Kao, A., et al. Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes. Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).
- Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes. Methods. 61 (2), 98-104 (2013).
- Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase. J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).
- Havugimana, P. C., et al. A census of human soluble protein complexes. Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).
- Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).
- Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome. Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).
- Liu, F., Heck, A. J. Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry. Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).
- Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
- Heide, H., et al. Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex. Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).
- Wessels, H. J., et al. Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling. PLoS One. 8 (7), 68340 (2013).
- Wessels, H. J., et al. LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes. Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).
- Remmerie, N., et al. Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods. J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).
- Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry. Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).
- Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells. Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Cox, J., et al. A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics. Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).
- Kim, J. J., et al. A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells. J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).
- Lauberth, S. M., Rauchman, M. A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex. J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).
- Miller, A., et al. Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex. Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).
- Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases. J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics. Nucleic Acids Res. 41 (1), 28 (2013).
- Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners. J Proteomics. 100, 55-59 (2014).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).
- Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
- Schagger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).
- Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach. Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).
- Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry. Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).
