Bir Ismarlama HPLC Arıtma Protokolü That Oligomer Formasyonu Yetenekli Verim Yüksek saflıkta Amiloid Beta 42 ve Amiloid Beta 40 peptidler,
Summary
Bu yazıda oligomer oluşturabilen yüksek saflıkta amiloid beta 42 (Aβ42) ve amiloid beta 40 (Aβ40) peptidler, veren bir özel HPLC arıtma protokolü sunduk. Amiloid P Alzheimer hastalığında rol yüksek çekiş eğilimli hidrofobik peptittir. peptid amiloidojenik doğası onun saflaştırma bir meydan okuma yapar.
Abstract
Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer’s disease-implicated Amyloid beta (Aβ), can present a significant challenge when trying to obtain high purity material. Here we present a tailored HPLC purification protocol to produce high-purity amyloid beta 42 (Aβ42) and amyloid beta 40 (Aβ40) peptides. We have found that the combination of commercially available hydrophobic poly(styrene/divinylbenzene) stationary phase, polymer laboratory reverse phase – styrenedivinylbenzene (PLRP-S) under high pH conditions, enables the attainment of high purity (>95%) Aβ42 in a single chromatographic run. The purification is highly reproducible and can be amended to both semi-preparative and analytical conditions depending upon the amount of material wished to be purified. The protocol can also be applied to the Aβ40 peptide with identical success and without the need to alter the method.
Introduction
Alzheimer hastalığı bir nörodejeneratif bir hastalıktır etkileri 35 milyondan fazla kişi dünya çapında. Hastalığın başlangıcı ve gelişiminde güçlü Belirtilmiş 1, yüksek toplama eğilimli, hidrofobik peptid Amiloid beta (Aβ) 'dir. 2 Aβ Ancak, beta amiloid 42 (Aβ42), proteinin en toksik bir şekilde 42-amino asit türevi olduğu düşünülmektedir, uzunluğu 36 ila 43 amino asit arasında değişir. 3 Bu hali hazırda, özellikle nörotoksik maddeler olduğu düşünülmektedir yayılabilir oligomerik türler oluşturma Aβ42 yeteneğini büyük bir kısmında kaynaklanmaktadır. 4 Aβ peptid anlayışımızı ilerletmek için, rutin yüksek saflıkta malzeme elde etmek esastır. saf olmayan artıklarının varlığı büyük ölçüde peptidin birikme eğilimi özelliklerini değiştirmek için gösterilmiştir. 5
Traditionally, örneğin Aβ hidrofobik peptitler, yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ayırma C 4 ya da Cı 8 silis bazlı sabit fazlarda ve bir asidik mobil faz bir kombinasyonunun kullanımı ile yapılmıştır. 6 Ancak, bu tür koşullar peptid saflaştırılması için bir meydan okuma sunabilir. Aβ peptidi düşük izoelektrik noktası (pl yaklaşık 5.5) 7, asidik koşullar altında, peptid agregasyon artar ve bunun bir sonucu olarak genellikle izole etmek zordur, geniş olmayan çözüldü HPLC tepe (Şekil 2A) üretilmeleri anlamına gelir. Ayrıca, bu tür geniş zirveler genellikle peptid toplama profilini etkileyebilecek ve yaygın dramatik üretilen peptid miktarını etkileyebilir arınma sonraki mermi gerektirebilir safsızlıklar içermezler.
poli (stiren / divinilbenzen) durağan faz, PLRP-S, saflaştırmadan bir alternatif araçları temsil ederYing hidrofobik peptitler. hareketsiz faz farklı protein ve haberci ribonükleik asitlerin (mRNA) 'in bir dizi saflaştırılmasında kullanılmıştır. 8, 9 PLRP-S sabit faz ters faz ayrılması için ek bir alkil ligandı gerektirir ve daha da önemlisi, peptidin agregadan arındırma çaresinin yol açan yüksek pH değerinde kimyasal olarak kararlıdır. 7 Burada, yüksek saflıkta amiloid beta 42 (Aβ42) ve amiloid beta 40 (Aβ40) peptidleri veren bir özel HPLC arıtma protokolü sunduk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aβ peptidi HPLC saflaştırma arıtılmadan kullanılan durağan faz peptid elüt edilmesi için seçilen mobil faz iki seçimi oldukça bağlıdır. toplama peptidin yüksek eğilimi düşük izoelektrik noktası Aβ peptidi uzun bir geniş olmayan çözüldü olarak elüsyon ile hidrofobik proteinlerin ayrılması (C4 veya asidik bir mobil elüsyon ile birleştirilmiş C8 faz) zor geleneksel kromatografik koşullan sağlamaya pik (Şekil 2A).
Yüksek pH değerinde kimyasa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar teknik yardım için Agilent teşekkür etmek istiyorum. Kate Markham ve Rafael Palomino Dr Hsiau-Wei Lee yazının Şekil 1 hazırlanmasında yaptığı yardım için teşekkür edilmektedir Aβ peptid ve onların ilk sentezinde yardım ve arıtma için yatırılır.
Materials
| Agilent 1260 Infinity II quarternary pump | Agilent | G7111B | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump |
| Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detector | Agilent | G7114A | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector |
| Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loop | Agilent | 0101-1232 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 µL stainless steel sample loop | Agilent | G1328C | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Ring Stand Mounting Bracket | Agilent | 1400-3166 | |
| PEEK Tubing Blue (1/32" outer diameter х 0.010" internal diameter) | Thermo Scientific | 03-050-399 | |
| Agilent PLRP-S 300Å 8µm 25 х 300 mm column (Preparative) | Agilent | PL1212-6801 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Agilent PLRP-S 300Å 8µm 7.5 х 300 mm (Semi-Preparative) | Agilent | PL1112-6801 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Agilent PLRP-S 300Å 5 µm 4.6 x 250 mm (Analytical) | Agilent | PL1512-5501 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Aβ42 or Aβ40 peptide | Synthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer. | ||
| Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution) | Fisher Scientific | A669-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Falcon 50 ml conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-954-49A | |
| Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 ea | Sigma-Aldrich | Z227250 | |
| Normject 5cc sterile syringe | Fisher Scientific | 1481729 | |
| 16 Gauge SS Needle | Rheodyne | 3725-086 |
References
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer’s Disease. N. Engl. J. Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- McGowan, E., et al. Aβ42 Is Essential for Parenchymal and Vascular Amyloid Deposition in Mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
- Gong, Y., et al. Alzheimer’s disease-affected brain: Presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (18), 10417-10422 (2003).
- Selkoe, D. J. Soluble Oligomers of the Amyloid β-Protein Impair Synaptic Plasticity and Behavior. Behav Brain Res. 192 (1), 106-113 (2008).
- Zagorski, M. G., Yang, J., Shao, H., Ma, K., Zeng, H., Hong, A. Methodological and Chemical Factors Affecting Amyloid β Peptide Amyloidogenicity. Methods Enzymol. 309, 189-204 (1999).
- Kim, W., Hecht, M. H. Mutations Enhance the Aggregation Propensity of the Alzheimer’s Aβ Peptide. J Mol Bio. 377 (2), 565-574 (2008).
- Fezoui, Y., et al. An improved method of preparing the amyloid beta-protein for fibrillogenesis and neurotoxicity experiments. Amyloid. 7 (3), 166-178 (2000).
- Zhelev, N. Z., Barratt, M. J., Mahadevan, L. C. Use of reversed-phase high-performance liquid chromatography on polystyrene-divinylbenzene columns for the rapid separation and purification of acid-soluble nuclear proteins. J Chromatogr A. 763 (1-2), 65-70 (1997).
- Thess, A., et al. Sequence-engineered mRNA Without Chemical Nucleoside Modifications Enables an Effective Protein Therapy in Large Animals. Mol Ther. 23 (9), 1456-1464 (2015).
- Warner, C. J. A., Dutta, S., Foley, A. R., Raskatov, J. A. Introduction of D-glutamate at a critical residue of Aβ42 stabilizes a pre-fibrillary aggregate with enhanced toxicity. Chem Eur J. 22 (34), 11967-11970 (2016).
- Thompson, J. A., Lim, T. K., Barrow, C. J. On-line High-performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometric Investigation of Amyloid-β Peptide Variants Found in Alzheimer’s Disease. Rapid Commun. Mass Spectrom. 13 (23), 2348-2351 (1999).
- Layne, E. Spectrophotometric and turbidimetric methods for measuring proteins. Met. Enzymology. 3, 447-455 (1957).
- Ioannou, J. C., Donald, A. M., Tromp, R. H. Characterizing the secondary structure changes occurring in high density systems of BLG dissolved in aqueous pH 3 buffer. Food Hydro. 46, 216-225 (2015).
- Rahimi, F., Maiti, P., Bitan, G. Photo-Induced Cross-Linking of Unmodified Proteins (PICUP) Applied to Amyloidogenic Peptides. J. Vis. Exp. (23), e1071 (2009).
- Bitan, G., Kirkitadze, M. D., Lomakin, A., Vollers, S. S., Benedek, G. B., Teplow, D. B. Amyloid β-protein (Aβ) assembly: Aβ40 and Aβ42 oligomerize through distinct pathways. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (1), 330-335 (2003).
