Ein Tailored HPLC Reinigungsprotokoll, dass die Renditen hochreine Amyloid Beta 42 und Amyloid Beta 40 Peptides, Fähig zur Oligomerbildung
Summary
Wir berichten hier über eine HPLC-Reinigung Protokoll zugeschnitten, die hochreine Beta-Amyloid-42 (Aß42) und Beta-Amyloid-40 (Aβ40) Peptide, der fähig Oligomerbildung ergibt. Amyloid beta ist ein hoch Aggregation neigen, hydrophoben Peptid in Alzheimer-Krankheit in Verbindung gebracht. Die amyloidogenen Natur des Peptids macht seine Reinigung eine Herausforderung.
Abstract
Amyloidogenic peptides such as the Alzheimer’s disease-implicated Amyloid beta (Aβ), can present a significant challenge when trying to obtain high purity material. Here we present a tailored HPLC purification protocol to produce high-purity amyloid beta 42 (Aβ42) and amyloid beta 40 (Aβ40) peptides. We have found that the combination of commercially available hydrophobic poly(styrene/divinylbenzene) stationary phase, polymer laboratory reverse phase – styrenedivinylbenzene (PLRP-S) under high pH conditions, enables the attainment of high purity (>95%) Aβ42 in a single chromatographic run. The purification is highly reproducible and can be amended to both semi-preparative and analytical conditions depending upon the amount of material wished to be purified. The protocol can also be applied to the Aβ40 peptide with identical success and without the need to alter the method.
Introduction
Alzheimer-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung, die Auswirkungen über 35 Millionen Menschen weltweit. 1 stark bei der Entstehung und Entwicklung der Krankheit in Verbindung gebracht, ist die hoch Aggregation neigen, hydrophoben Peptid Amyloid beta (Aß). 2 Aß im Bereich von 36 bis 43 Aminosäuren in der Länge, aber es wird angenommen , daß die 42-Aminosäurevariante Amyloid beta 42 (Aß42), ist die toxische Form des Proteins. 3 Dies ist zum größten Teil auf die Fähigkeit von Aß42 zu leicht diffusionsfähig, oligomere Spezies bilden , die vermutlich besonders neurotoxischen Einheiten sein. 4 Um unser Verständnis des Aß – Peptid zu fördern, ist es wichtig , regelmäßig zu hochreinem Material zu erhalten. Das Vorhandensein von Spurenverunreinigungen hat sich gezeigt, dramatisch die Aggregationsneigung Eigenschaften des Peptids zu verändern. 5
Trüher, wurde durch die Verwendung einer Kombination von C 4 oder C 8 Siliciumdioxid basierenden stationären Phasen und einer sauren mobilen Phase die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) -Trennung von hydrophoben Peptiden , wie beispielsweise Aß getan. 6 Jedoch können solche Bedingungen eine Herausforderung für die Reinigung des Peptids darstellen. Der niedrige isoelektrische Punkt des Aß – Peptid (pI ungefähr 5,5) , 7 bedeutet , daß unter sauren Bedingungen, Peptidaggregation erhöht wird und als Ergebnis breite, nicht aufgelöste HPLC – Peaks , die oft schwierig zu isolieren sind (2A) hergestellt. Ferner können solche breite Peaks enthalten oft Verunreinigungen, die die Aggregationsprofil des Peptids beeinflussen können, und erfordern häufig nachfolgenden Runden der Reinigung, die die Menge an Peptid dramatisch beeinflussen können hergestellt werden.
Die Poly (Styrol / Divinylbenzol) stationäre Phase, PLRP-S stellt ein alternatives Mittel zur purifying hydrophobe Peptide. Die stationäre Phase wurde bei der Reinigung von einer Reihe von verschiedenen Proteinen und messenger-Ribonukleinsäuren (mRNA) eingesetzt werden. 8, 9 Die PLRP-S stationäre Phase erfordert keine zusätzliche Alkylliganden für Umkehrphasentrennung, und was noch wichtiger ist , bei hohen pH chemisch stabil, die Desaggregation des Peptids führt. 7 Hier berichten wir über eine maßgeschneiderte HPLC – Reinigung – Protokoll , das hochreine Beta – Amyloid-42 (Aß42) und Beta – Amyloid-40 (Aβ40) Peptide ergibt.
Protocol
Representative Results
Discussion
The HPLC purification of the Aβ peptide is highly dependent upon the choice of both the stationary phase employed in the purification and the mobile phase chosen to elute the peptide. The low isoelectric point of the peptide and high propensity for aggregation render traditional chromatographic conditions for the separation of hydrophobic proteins (C4 or C8 stationary phase coupled with an acidic mobile eluent) challenging, with the Aβ peptide eluting as a prolonged broad, non-resolved peak (Figure 2A</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Agilent for their technical assistance. Kate Markham and Rafael Palomino are credited for their initial help in the synthesis and purification of the Aβ peptide and Dr Hsiau-Wei Lee is thanked for his help in preparing Figure 1 of the manuscript.
Materials
| Agilent 1260 Infinity II quarternary pump | Agilent | G7111B | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-pumps-vacuum-degassers/1260-infinity-ii-quaternary-pump |
| Agilent 1260 Infinity II Dual variable wavelength detector | Agilent | G7114A | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-detectors/1260-infinity-ii-variable-wavelength-detector |
| Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 10 mL stainless steel sample loop | Agilent | 0101-1232 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Agilent 1260 Infinity II Manual Injector fitted with 20 µL stainless steel sample loop | Agilent | G1328C | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-injection-systems/1260-infinity-ii-manual-injector |
| Ring Stand Mounting Bracket | Agilent | 1400-3166 | |
| PEEK Tubing Blue (1/32" outer diameter х 0.010" internal diameter) | Thermo Scientific | 03-050-399 | |
| Agilent PLRP-S 300Å 8µm 25 х 300 mm column (Preparative) | Agilent | PL1212-6801 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Agilent PLRP-S 300Å 8µm 7.5 х 300 mm (Semi-Preparative) | Agilent | PL1112-6801 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Agilent PLRP-S 300Å 5 µm 4.6 x 250 mm (Analytical) | Agilent | PL1512-5501 | http://www.agilent.com/en-us/products/liquid-chromatography/lc-columns/biomolecule-separations/plrp-s-for-biomolecules#features |
| Aβ42 or Aβ40 peptide | Synthesized in-house using a CEM liberty automated peptide synthesizer. | ||
| Ammonium Hydroxide (NH4OH, 28% solution) | Fisher Scientific | A669-500 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | A998-4 | |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5-4 | |
| Falcon 50 ml conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-954-49A | |
| Supelco PEEK Fitting One-piece fingertight, pkg of 5 ea | Sigma-Aldrich | Z227250 | |
| Normject 5cc sterile syringe | Fisher Scientific | 1481729 | |
| 16 Gauge SS Needle | Rheodyne | 3725-086 |
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