الرئة ماوس شرائح لتصور لايف الخلايا الجذعية الرئوي قطع الدقة
Summary
نحن تصف طريقة لتوليد قطع الدقة الرئة شرائح (PCLS) والمناعية لهم لتصور توطين مختلف أنواع الخلايا المناعية في الرئة. ويمكن تمديد بروتوكول لدينا تصور موقع وظيفة العديد من أنواع مختلفة من الخلايا في إطار مجموعة من الشروط.
Abstract
استنشاق المواد المسببة للحساسية والجراثيم يثير عدة تغييرات في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المناعية في الرئة. التدفق الخلوي هو أسلوب قوية للتحليل الكمي للبروتينات سطح الخلية في الخلايا المناعية، لكنه لا يقدم أي معلومات عن التوطين والهجرة أنماط من هذه الخلايا داخل الرئة. وبالمثل، المقايسات الكيميائي يمكن أن يؤديها لدراسة إمكانية الخلايا على الاستجابة للعوامل الكيميائي في المختبر، ولكن هذه المقايسات لا تتكاثر في بيئة معقدة في الرئة سليمة. وعلى النقيض من هذه التقنيات المذكورة أعلاه، وموقع من أنواع الخلايا الفردية داخل الرئة يمكن تصور بسهولة عن طريق توليد خفض الدقة والرئة شرائح (PCLS)، تلطيخ لهم المتاحة تجاريا الأجسام المضادة، الموسومة fluorescently، وتصور المقاطع بواسطة المجهر متحد البؤر. PCLS يمكن أن تستخدم في كل من يعيش وأنسجة الرئة ثابتة، ويمكن للشرائح تشمل مناطق كبيرة مثل شريحة من الفص كامل. وقد استخدمنا هذا البروتوكول لتصور بنجاح مكان وجود مجموعة واسعة من أنواع الخلايا في الرئة، بما في ذلك أنواع متميزة من الخلايا الجذعية، الضامة، العدلات، وخلايا T والخلايا B، وكذلك خلايا هيكلية مثل اللمفاوية، البطانية، و الخلايا الظهارية. القدرة على تصور التفاعلات الخلوية، مثل تلك التي بين الخلايا الجذعية وخلايا T، في العيش، وأنسجة الرئة ثلاثية الأبعاد، يمكن أن تكشف عن كيفية تحرك الخلايا داخل الرئة وتتفاعل مع بعضها البعض في حالة مستقرة وخلال الالتهاب. وهكذا، عندما تستخدم بالاقتران مع إجراءات أخرى، مثل التدفق الخلوي وPCR الكمي، PCLS يمكن أن تسهم في فهم شامل من الأحداث الخلوية التي تكمن وراء أمراض الحساسية والتهابات الرئة.
Introduction
عقب استنشاق من المحفزات الموالية للالتهابات مثل lipopolysaccharide في (LPS)، وهناك حركة منسقة من الخلايا المناعية إلى داخل، ومن الرئة. على سبيل المثال، يتم تجنيد العدلات بسرعة في لحمة الرئة والشعب الهوائية. وبالإضافة إلى ذلك، بعض مستضد الخلايا المهنية المعروفة باسم الخلايا الجذعية التقليدية (جان تنمية المجتمعات المحلية) تخضع لنمط الهجرة معقدة نسبيا 1 و 2. ويمكن تحديد جان تنمية المجتمعات المحلية باستخدام التدفق الخلوي، ومقرها في جزء منها على العرض الخاصة بها من علامة السطح، CD11c و. فرعية متميزة من البلدان النامية يمكن تمييزها عن طريق التعبير عن سطح التفاضلية للCD103 وCD11b 3. على الحصول على مستضد استنشاق بعض جان تنمية المجتمعات المحلية الخروج من الرئة وتهاجر من خلال الأوعية الليمفاوية إلى استنزاف الرئة الغدد الليمفاوية (LNS) حيث أنها تقدم الببتيدات لمستضد محددة الخلايا T 4. هذا حدث في وقت مبكر حاسما في بدء ص المناعة التكيفيةesponses. لأسباب غير معروفة، ولكن، ليس كل جان تنمية المجتمعات المحلية التي تحصل على مستضدات استنشاق ترك الرئة، وتبقى العديد من هذه الخلايا في هذا الجهاز لعدة أشهر 5، 6. هذه الملاحظة يمكن تفسيرها جزئيا من أصل التنموي من هذه الخلايا لالوحيدات المستمدة CD11c و+ خلايا تفتقر إلى مستقبلات chemokine، CCR7، غير قادرين على الهجرة إلى LNS الإقليمية 7 و 8. ويبدو من المرجح أن إمكانيات هجرة جان تنمية المجتمعات المحلية ويتحدد أيضا، على الأقل جزئيا، من خلال وضع تشريحي في غضون الرئة. ومع ذلك، لا تتميز بشكل كامل التعريب الدقيق لهذه مجموعات مختلفة من جان تنمية المجتمعات المحلية في الرئة. معرفة محسنة لتوطين الخلايا المناعية في الرئة، والجزيئات التي توجه إليها، وهناك حاجة لفهم أفضل لكيفية عمل نظام المناعة في الرئة يصبح تفعيلها.
PCLS يجري يتزايدتستخدم لاي كنهج خارج الحي لتصور المواقع الخلوية وخلية خلية التفاعلات، مع الحفاظ على السلامة الهيكلية للبنية الرئة 9، 10. وقد استخدمت PCLS لدراسة الرئتين لكثير من الأنواع، بما في ذلك الفئران والأبقار والقرود والأغنام والخيول، والبشر (11). والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أن ما يقرب من 20 شرائح يمكن إعداد من الفص واحد من الرئة الماوس، مما يقلل من عدد الحيوانات اللازمة لإجراء التجارب الفردية. تقريبا جميع أنواع الخلايا المناعية، بما في ذلك البلدان النامية، الضامة، العدلات، والخلايا T، موجودة في PCLS والحفاظ على هياكلها العادية.
يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة PCLS إشارات الكالسيوم وانقباض الخلايا الهوائية والعضلات الملساء بعد العلاج مع أستيل 12 أو 13 ميثاكولين. في هذا النهج، سوى جزء صغير من الرئة هوalyzed مجهريا، ولكن ذكرت إحدى الدراسات أن قياسات انكماش الهوائية في PCLS تختلف حوالي 10٪ فقط من شريحة إلى شريحة، وهذه الفرق هي مماثلة لتلك التي شوهدت باستخدام اختبارات وظائف الرئة في الحيوانات سليمة 14. وقد استخدم باحثون آخرون PCLS كنهج خارج الحي لدراسة التغيرات في التعبير خلوى وسطح الخلية علامات بعد الحضانة مع LPS 15. كما استخدمت PCLS في نموذج المجراة سابقا من تضيق الأوعية الرئوية نقص الأوكسجين في الشرايين الصغيرة داخل عنيبية. تقع هذه السفن في جزء من الرئة التي لا يمكن الوصول إليها باستخدام إجراءات أخرى، بما في ذلك تسجيلات من شرائح الشريانية تشريح أو تحليل السفن تحت الجنبة 16. وقد استخدمت مختبرنا في المقام الأول PCLS لتصور توطين الخلايا المناعية في أنسجة الرئة يعيش في حالة مستقرة وبعد في الجسم الحي تحفيز التهابات. الإجراءات وضعنا لذلك هي على النحو التالي.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم تطوير هذا البروتوكول هو موضح هنا أصلا لتصور مواقع اثنين من مجموعات فرعية من جان تنمية المجتمعات المحلية داخل الرئة. ومع ذلك، هذا البروتوكول يمكن تكييفه بسهولة لدراسة العديد من أنواع مختلفة من الخلايا، مع الحفاظ على سلامة الخلية والهندسة المعمارية ثلاثية الأب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جيف تاكر، إريكا سكابيني، وأغنس جانوشازي لمساعدتهم مع المجهر، ليغون بيرو لإدارة لها من مستعمرة الماوس، وجون تشن ومايكل ساندرسون للمساعدة في تقطيع اللحم والأنسجة، ومايكل فيسلر وديريك كين لقراءة نقدية لل المخطوطة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل فرع جماعية من معهد علوم الصحة البيئية، NIH (ضياء ES102025-09)، والذي بدوره برعاية وزارة الصحة والخدمات الإنسانية.
Materials
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Prox1-TdTomato transgenic mice | Jackson Laboratory | 018128 | B6;129S-Tg(Prox1-tdTomato)12Nrud/J |
| OT-II OVA-specific TCR x Nur77-GFP transgenic mice | Jackson Laboratory | 004194, 006617 | B6.Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL/6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J |
| Rag1 knock-out mice | Jackson Laboratory | 002216 | B6.129S7-Rag1tm1Mom/J |
| Ovalbumin, Low Endo, Purified | Worthington Biochemical Corporation | LS003059 | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli | Sigma-Aldrich Co. | L2630-25MG | |
| Polyethylene tubing (Non-Sterile) 100 ft | BD Diagnostic Systems | 427421 | 0.86 mm inside diameter, 1.27 mm outside diameter |
| GeneMate Sieve GQA Low Melt Agarose | BioExpress | E-3112-125 | 2% solution dissolved in PBS at 70 °C and held at 40 °C. |
| Compresstome VF-300 | Precisionary Instruments, Inc. | VF-300 | |
| Double Edge Stainless Razor Blade | Electron Microscopy Sciences | 72000 | Disposable; 250/box. Blade should be changed for every lung. |
| Krazy Glue All Purpose Instant Gel | VWR | 500033-484 | Commonly available for $3/tube in local drugstores |
| Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red | ThermoFisher Scientific | 21083027 | |
| Normal Rat Serum | Jackson ImmunoResearch Inc. | 012-000-120 | |
| Normal Mouse Serum | Jackson ImmunoResearch Inc. | 015-000-120 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30071.03HI | |
| Staining Buffer | Made in House | N/A | PBS w/ 0.5% bovine serum albumin, 0.1% NaN3, pH 7.4 |
| Fc Blocker (anti-CD16/32 antibodies) | Made in House | N/A | Supernatant of cultured hybridoma cell line 2.4G2 |
| Anti-mouse CD11b eFluor 450 | eBioscience | 48-0112-80 | Anti-mouse CD11b eFluor 450 (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Brilliant Violet 605 | BioLegend | 101237 | Brilliant Violet 605 anti-mouse CD11c (clone: M1/70) |
| Anti-mouse CD11c Phycoerythrin | eBioscience | 12-0114-82 | PE conjugated anti-mouse CD11c (clone: N418) |
| Anti-mouse CD11c Allophycocyanin | BD Phamingen | 550261 | APC-labeled anti-mouse CD11c 9clone: HL3) |
| Anti-mouse CD88 Phycoerythrin | BioLegend | 135806 | PE anti-mouse CD88 (clone: 20/70) |
| Anti-mouse CD103 Allophycocyanin | eBioscience | 17-1031-82 | Anti-mouse CD103 APC (clone: 2E7) |
| Anti-mouse CD90.2/Thy1.2 eF450 | eBioscience | 48-0902-82 | Anti-mouse CD90.2 eFluor 450 (clone: 53-2.1) |
| Anti-mouse CD172a/Sirp1a Allophycocyanin | eBioscience | 17-1721-82 | Anti-mouse CD172a APC (clone: P84) |
| Anti-mouse CD324 Brilliant Violet 421 | BD Horizon | 564188 | BV421 mouse anti-E Cadherin (clone: 5E8 also known as 5E8-G9-B4) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 488 | eBioscience | 53-3249-82 | Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 488 (clone: DECMA-1) |
| Anti-mouse CD324 Alexa Fluor 647 | eBioscience | 51-3249-82 | Anti-CD324(E-Cadherin) Alexa Flour 647 (clone: DECMA-1) |
| Glass Bottom Microwell Dishes 35mm petri dish, 14mm Microwell, No. 1.5 coverglass | MatTek Corperation | P35G-1.5-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | ThermoFisher Scientific | 155411PK | Pack of 16 |
| 15 mm Coverslip, No. 1.5 Glass Thickness | MatTek Corperation | PCS-1.5-15 | |
| Bare Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP201 | 0.020" (0.5mm) diameter cut into ~1 cm long pieces and bent into an "L" shape |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher Scientific | P36934 | Keep at 4 °C, warm to room tempterature before use. |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free, *LDEV-Free | Corning | 356231 | |
| Zeiss 880 multi-photon laser-scanning microscope | Carl Zeiss | Zen Black software version 8.1, 2012 (Zeiss) | |
| Plan-Apochromat 20x/0.8 M27 objective lends | Carl Zeiss | 420650-9901-000 |
References
- Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model. Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).
- Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A. Specific migratory dendritic cells rapidly transport antigen from the airways to the thoracic lymph nodes. J Exp Med. 193 (1), 51-60 (2001).
- Sung, S. S., et al. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J Immunol. 176 (4), 2161-2172 (2006).
- Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nat Med. 13 (10), 1155-1159 (2007).
- Jakubzick, C., et al. Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes. J Exp Med. 205 (12), 2839-2850 (2008).
- Julia, V., et al. A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific T cells long after antigen exposure. Immunity. 16 (2), 271-283 (2002).
- Nakano, H., et al. Migratory properties of pulmonary dendritic cells are determined by their developmental lineage. Mucosal Immunol. 6 (4), 678-691 (2013).
- Nakano, H., et al. Complement receptor C5aR1/CD88 and dipeptidyl peptidase-4/CD26 define distinct hematopoietic lineages of dendritic cells. J Immunol. 194 (8), 3808-3819 (2015).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulm Pharmacol Ther. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liberati, T. A., Randle, M. R., Toth, L. A. In vitro lung slices: a powerful approach for assessment of lung pathophysiology. Expert Rev Mol Diagn. 10 (4), 501-508 (2010).
- Parrish, A. R., Gandolfi, A. J., Brendel, K. Precision-cut tissue slices: applications in pharmacology and toxicology. Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).
- Bergner, A., Sanderson, M. J. ATP stimulates Ca2+ oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (6), L1271-L1279 (2002).
- Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur Respir J. 9 (12), 2479-2487 (1996).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).
- Henjakovic, M., et al. Ex vivo lung function measurements in precision-cut lung slices (PCLS) from chemical allergen-sensitized mice represent a suitable alternative to in vivo studies. Toxicol Sci. 106 (2), 444-453 (2008).
- Paddenberg, R., et al. Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices. Respir Res. 7, 93 (2006).
- Wilson, R. H., et al. Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 180 (8), 720-730 (2009).
- Schlitzer, A., et al. Identification of cDC1- and cDC2-committed DC progenitors reveals early lineage priming at the common DC progenitor stage in the bone marrow. Nat Immunol. 16 (7), 718-728 (2015).
- Baluk, P., et al. Preferential lymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lung inflammation. Am J Pathol. 184 (5), 1577-1592 (2014).
- Jurisic, G., Iolyeva, M., Proulx, S. T., Halin, C., Detmar, M. Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium. Exp Cell Res. 316 (17), 2982-2992 (2010).
- Truman, L. A., et al. ProxTom lymphatic vessel reporter mice reveal Prox1 expression in the adrenal medulla, megakaryocytes, and platelets. Am J Pathol. 180 (4), 1715-1725 (2012).
- Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
