Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Durante las últimas décadas, los avances se han hecho importantes en el desarrollo de técnicas analíticas diseñadas para medir la estructura de la proteína y la dinámica de ^{1, 2, 3, 4.} Mientras que la cristalografía de rayos X sigue siendo la herramienta principio para la determinación de la estructura de proteínas, se necesitan altas concentraciones de proteína y se requiere una amplia optimización para producir cristales de calidad de difracción. Las proteínas que son difíciles de cristalizar, tales como proteínas asociadas a la membrana y intrínsecamente desordenadas clásicamente se han estudiado por intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX) RMN ^5. Sin embargo, en las últimas décadas, el acoplamiento de ionización por electrospray espectrometría de masas (ESI-MS) para HDX ha ganado rápidamente popularidad ^{6, 7.}

Espectrometría de masas ofrece una solucióna muchas de las restricciones planteados por cristalografía de rayos X y RMN. En particular, MS es altamente sensible (nM a concentraciones mu M se requiere), y prácticamente no hay límite en el tamaño de la proteína. Además, el ciclo de trabajo alto de análisis MS permite la posibilidad de estudiar proteínas que sean sometidos a rotación enzimática, mal plegamiento, formación de complejos y otros procesos biológicamente relevantes. Estos procesos ocurren a menudo en el milisegundo a segunda escala de tiempo y requieren un mezclado rápido de los reactivos antes del análisis.

El desarrollo de resuelta en el tiempo de ionización por electrospray (tresi) por Wilson y Konermann en 2003 reacciones se permite monitorizar en tiempo real mediante la pseudo-ESI-MS. Su configuración incorpora un mezclador capilar con un volumen de cámara de reacción continuamente ajustable ^8. El dispositivo consta de dos capilares concéntricos, con el capilar interior sellado y una muesca cortada en su lado para permitir la mezcla dentro de la estrecha inter-capillary el espacio de la muesca en el extremo del capilar interior (típicamente 2 mm). Cuando se aplica a experimentos HDX, el capilar interior lleva la proteína de interés, el capilar exterior lleva el etiquetado _D2O solución, que sufre a continuación la mezcla con la proteína antes de entrar en la cámara de reacción ajustable que permite para el etiquetado HDX antes de la transferencia directa en el ESI fuente.

Brevemente, HDX se basa en hidrógenos amida de cadena principal sometidos a intercambio con átomos de deuterio en solución ^{9, 10.} El intercambio es catalizada por bases a pH fisiológico, con ácido-catálisis convertirse en predominante a pH por debajo de aproximadamente 2,6. La tasa de cambio se basa en cuatro factores principales: pH, temperatura, disolvente accesibilidad y de enlace de hidrógeno intramolecular. Como los dos primeros factores se mantienen constantes durante todo el experimento, la tasa de cambio, en particular en las posiciones de amida del esqueleto peptídico, es principalmente dependent en la estructura de proteínas ^11. Bien doblado regiones con extensas redes de enlaces de hidrógeno, estables en alfa-hélices y láminas beta se llevará hasta deuterio a velocidades sustancialmente más lento en comparación con los bucles y las regiones desordenadas (y, a veces no en todos) ^12. Esto permite el análisis de proteína global, donde las perturbaciones en la estructura (por ejemplo., Sobre la agregación o de unión al sustrato) conducen a diferentes captación de deuterio (Figura 1).

El mezclador capilar cinética puede ser incorporado en una plataforma de microfluidos que contiene una cámara proteolítica para la localización de la captación de deuterio. Esta cámara proteolítica se lleva a cabo a pH bajo con el fin de apagar efectivamente la reacción de intercambio, y requiere una proteasa ácida inmovilizada con el fin de digerir la proteína en péptidos localizados (Figura 2). Supervisión de Exchange columna vertebral en milisegundos a escalas segunda vez es especialmente importante para lacaracterización de cambios conformacionales dentro de difícil caracterizar regiones de bucle, glóbulos fundidos, y proteínas intrínsecamente desordenadas (PDI) ^{13, 14.} Alternativamente, tresi-HDX también se puede utilizar para caracterizar las proteínas que actualmente no tienen una estructura atómica resuelto a través de los métodos de cristalografía de rayos X y RMN, usando intercambio de deuterio acoplado al algoritmo de COREX (DX-COREX) enfoque ^{15, 16.} Este protocolo detallado se aplicará tresi-HDX para estudiar tau, un desplazado interno, tanto en su forma nativa, así como su estado hiperfosforilada patógeno. Mientras que la TAU nativa es una de las PDI más bien estudiado, se sabe poco sobre su contraparte amiloidogénica ^13.