JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物化学

SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi

Published: May 16, 2017
doi:
10.3791/55448
, , , , , , , ,
1Department of Structural Biochemistry,Max Planck Institute of Molecular Physiology, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology,The University of Texas Medical School at Houston

Summary

Bu makale SPHIRE yazılım paketini kullanarak cryo-EM görüntüleri işlemek için bir protokol sunmaktadır. Mevcut protokol, neredeyse atomik çözünürlüğü hedefleyen hemen hemen tüm tek parçacılı EM projeleri için uygulanabilir.

Abstract

SPHIRE (Yüksek Çözünürlüklü Elektron Mikroskopisi için SPARX), tek parçacıklı elektron cryo-mikroskopi (cryo-EM) verilerinin yarı otomatik olarak işlenmesi için yeni ve açık kaynaklı, kullanıcı dostu bir yazılım paketidir. Burada sunulan protokol, kullanıcıları tek parçacıklı yapı tayini boru hattının tüm adımları boyunca yönlendirerek, cryo-EM mikrograf filmlerinden başlayarak atom-altı bir çözünürlük yapısının nasıl elde edilebileceğini ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu adımlar, yeni SPHIRE grafik kullanıcı arayüzünden kontrol edilir ve minimum kullanıcı müdahalesi gerektirir. Bu protokolü kullanarak, Photorhabdus luminescens'den bir Tc toksin kompleksi olan 3.5Å yapıdaki TcdA1 , yalnızca 9500 tek parçacıktan türetilmiştir. Bu aerodinamik yaklaşım, acil makromoleküler komplekslerinin doğal hallerinde gürültülü ve tarafsız atomik modeller elde etmeleri için, kapsamlı bir işleme deneyimi olmayan acemi kullanıcılara ve önceden yapılmış bir yapısal bilgiye yardımcı olacaktır.

Introduction

Doğrudan elektron dedektörü teknolojisinin gelişmesinden sonra, tek parçacık kriyo-EM'deki dikkate değer ilerleme şu anda yapısal biyolojiyi yeniden şekillendirmektedir 1 . X-ışını kristalografisi ile karşılaştırıldığında, bu teknik, kristalizasyona gerek duymadan az miktarda protein materyali gerektirirken, aynı zamanda numunenin saflığı konusunda daha az kısıtlama getirmekte ve yine atomik çözünürlük yakınında yapıların belirlenmesine izin vermektedir. Önemlisi, şimdi farklı kompozisyonlar veya durumlar hesaplanabilir bir şekilde ayrılabilir ve farklı konformasyonların yapı belirlenmesi eşi benzeri görülmemiş detay seviyesinde yapılabilir. Son zamanlarda, zorlayıcı moleküllerin yoğunluk haritaları, de novo model yapımına izin veren çözünürlüklerde üretilebilir ve bu nedenle bunların hareket tarzlarının derin bir şekilde anlaşılması 2 , 3 , 4 , 5.

3DEM (3D Elektron Mikroskopisi) topluluğunda (https://tr.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) çok çeşitli görüntü işleme yazılım paketleri mevcuttur ve bunların çoğu sürekli geliştirilmektedir. EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 ve SPARX 11 gibi çeşitli yazılım paketleri ile çeşitli molekül ağırlığı ve simetrileri sergileyen proteinler için yaklaşık atom özünürlüğü elde edilmiştir. Her pakette kullanıcı uzmanlığının farklı bir seviyesi gerekiyor ve farklı düzeylerde kullanıcı kılavuzu, otomasyon ve genişletilebilirlik sağlıyor. Ayrıca, bazı programlar görüntü analizinin tüm adımlarını kolaylaştırmak için eksiksiz ortamlar sağlarken, bazıları bilinen r'den başlayarak hizalama parametrelerinin arıtılması gibi belirli görevleri optimize etmek üzere tasarlanmıştır.Eferans yapısı. Daha yakın tarihte, yukarıda listelenen farklı yazılım paketlerinden gelen yaklaşımları ve protokolleri birleştiren tek bir işleme hattı sağlayan APPION 12 ve SCIPION 13 dahil olmak üzere çeşitli platformlar geliştirildi.

Mevcut cryo-EM gelişimine katkıda bulunmak için SPARX, SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) adı verilen tek parçacık analizi için yeni ve bağımsız bir platform haline getirildi. Teknolojinin bu alandaki yeni araştırmacılar için erişilebilirliğini arttırmak ve modern tümüyle otomatikleştirilmiş üst düzey elektron mikroskopları tarafından üretilen büyük miktardaki verilere uyum sağlamak için, işleme hattı, kullanımı kolay bir tanıtılarak yeniden tasarlandı ve basitleştirildi Grafik Kullanıcı Arayüzü (GUI) ve iş akışının ana adımlarını otomatikleştirmek. Ayrıca, cr'den hızlı, tekrarlanabilir ve otomatik yapının belirlenmesine izin vermek için yeni algoritmalar eklenmiştir.Yo-EM görüntüleri. Ayrıca, arıtılma ve heterojenite analizi sırasında üretilen ortak eserlerden kaçınmak için tekrarlanabilirlik ile geçerlilik kazandırılmıştır.

Program kapsamlı bir şekilde değiştirilmesine rağmen, takdir edilen çekirdek özellikleri korunmuştur: basit açık kaynak kod, modern nesne yönelimli tasarım ve tüm temel fonksiyonlar için Python arayüzleri. Böylece, kullanıcıların Python kodunu inceleyip kolayca değiştirebilmelerini, ek uygulamalar yaratmalarını veya genel iş akışını değiştirmelerini sağlayan bir kara kutu programı olarak değiştirilmedi. Bu, standart olmayan cryo-EM projeleri için özellikle yararlıdır.

Burada, SPHIRE'nin GUI'sini kullanarak cryo-EM görüntülerinden atom-altı bir çözünürlük yoğunluğu haritası elde etmek için bir protokol sunuyoruz. Çiğ cryo-EM direkt dedektör filmlerinden yoğunluk haritası oluşturmak için gereken tüm aşamaları ayrıntılı olarak açıklar ve herhangi bir makromolekül tipi ile sınırlı değildir. Bu protokol esas olarak newc'yiIş akışıyla sahaya çıkıyor ve işlemenin önemli adımlarının yanı sıra olası tuzaklar ve engeller hakkında önemli bilgiler sağlıyor. Daha gelişmiş özellikler ve SPHIRE'nin arkasındaki teorik arka plan başka yerlerde açıklanacaktır.

Protocol

NOT: Bu protokolü izlemek için, SPHIRE'yi MPI kurulumu olan bir sisteme (şu an için bir Linux kümesi) düzgün bir şekilde yüklemek gerekir. Http://www.sphire.mpg.de adresinden SPHIRE ve TcdA1 veri setini indirin ve kurulum talimatlarını izleyin: http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:download. Bu prosedür aynı zamanda EMAN2'yi kurar. SPHIRE şu anda parçacık seçimi için EMAN2'nin e2boksörünü ve görüntü dosyalarını görüntülemek için e2display kullanıyor. Ham mikrofotoğraf filmlerinin doz ağırlıklı hareketi düzeltmesi için SPHIRE unblur 14 kullanır. Programı indirin ve yükleme talimatlarını izleyin (http://grigoriefflab.janelia.org/unblur, Grigorieff laboratuarı). Ortaya çıkan yapıların etkileşimli olarak görselleştirilmesi için, protokol moleküler grafik programı Chimera 15'i kullanacaktır (https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html). Bu protokol boyunca kullanılan özelliklere aşina olmak için hoş bir eğitim fou olabilirNd burada: https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/data/tutorials/eman07/chimera-eman-2007.html. Paralel bir işi SPHIRE GUI'den kümeye nasıl göndereceğinizle ilgili talimatları şu adreste bulabilirsiniz: http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php?id=howto:submissions. SPHIRE GUI'nin genel organizasyonu ve iş akışının bu protokol boyunca gerçekleştirilen ana adımları Şekil 1'de gösterilmiştir. 1. PROJE: Bu Proje için Sabit Parametre Değerlerini Ayarlayın Bir terminal penceresinde " sphire &" yazıp ENTER tuşuna basarak SPHIRE GUI uygulamasını başlatın. Proje ayarları sayfasının ilgili girdi alanlarındaki proje genelindeki parametreleri ( ör. Piksel boyutu, parçacık yarıçapı ve simetri) ayarlayın ve sonra bu değerleri iş akışının sonraki tüm adımları için kaydedin. Proje ayarları sayfasını açmak için sol panelin sağ alt tarafındaki "PROJE" simgesini tıklayın. <li> E2display.py görüntüsel etkileşimli görüntüleme aracını kullanarak bir parçacığın en uzun eksenini ölçün, ardından parçacık boyutunun yarısını "Protein parçacık yarıçapı" na girin. Ölçüm  ise, piksel boyutunu kullanarak birimi piksele dönüştürmek için aklınızda bulundurun ( örneğin, bir parçacık 200Å uzunluğunda ve piksel boyutu 1.2Å / piksel ise, parçacığın en uzun ekseni 200 / 1.2 = ~ 166 piksel ve yarıçap 166/2 = 83 piksel). "Parçacık kutusu boyutu", parçacık boyutunun en az 1.5 katına ayarlayın. Büyük asal sayı içeren pencere boyutlarından kaçının. Ayrıca, 3D arıtma algoritmasının şu anda çift sayılı bir kutu boyutu gerektirdiğini unutmayın. NOT: Pencere, toplama (pencere içindeki parçacıkların kayması ihtiyacı) ve uygun bir CTF düzeltmesi için parçacık sınırının dışındaki yeterli arka plan bölgesi için (özellikle büyük defocus değerleri için önemlidir) başlangıçtaki merkezleme hatalarını hesaba katmak için bir kenar boşluğu içermelidir <sup class = "xref"> 16). "CTF pencere boyutu" nu "Parçacık kutusu ebadı" değerine ayarlayın. Düşük kontrastlı projeler için, daha gçlü spektrum tahminleri elde etmek için daha büyük bir pencere kullanın. Kompleksin "Nokta-grubu simetrisi" ni ( örneğin, "C5") ayarlayın. Hedef yapının simetri bilinmiyorsa, "C1" (asimetrik) bırakın. Bununla birlikte, daha sonra belirli bir yüksek dereceli simetri belirlenirse, bu simetri ayarını buna göre değiştirin ve ISAC ile 2D hizalamadan sonraki adımları tekrarlayın. "Protein moleküler kütlesi" ni kDa cinsinden ayarlayın (yaklaşık değer yeterlidir). "Kayıt ayarları" düğmesine basın. 2. FİLM: Örnekin Genel Hareketini Düzeltmek İçin Her Bir Filmli Mikrograf Çerçevesini hizalayın Tüm film mikrograflarında, tüm kareler için x / y kaymalarını hesaplayın ve daha sonra doz ağırlıksız ve doz ağırlıklı mo oluşturun(Bkz. Tartışma). Birincisi, yalnızca CTF tahmini için gereklidir çünkü tahmin, doz ağırlıklı ortalamalarla iyi sonuç vermez, bunun ikincisi yapının belirlenmesinin diğer tüm aşamaları için kullanılır. "MOVIE" ikonuna ve sonra "Micrograph Movie Alignment" düğmesine tıklayın. Çalıştırılabilir dosyayı seçerek "Unblur çalıştırılabilir yolu" ayarlayın. Ham hareketsiz bir film mikrografı seçerek ve dosya adlarının değişken kısmını "*" joker karakteri ( örneğin, TcdA1 _ *. Mrc) ile değiştirerek "Giriş mikrografi yolu modeli" ayarlayın. "Çıkış dizini" için yolu belirtin. Çalışılabilir dosyayı seçerek "Yürütülebilir dosya toplamayı" ayarlayın. "Film kareleri sayısı" nı her bir filmdeki mikrografdaki karelerin sayısına ayarlayın. "Mikroskop voltajı" ve "Perde pozlama" değerlerini veri toplama sırasında kullanılan değerlere ayarlayın. (Examp içinLe, eğer toplam doz 20 pozlamalı önceden kaydedilmemişken kaydedilmiş 60 e – / Â2 ise, her karenin pozlama değeri 60/20 = 3 e – / A 2'dir .) "Komut Çalıştır" düğmesine basarak Her bir filmin mikrografının çerçeveleri. NOT: Bu, doz-ağırlıksız ve doz -ağırlıklı hareketi düzeltilmiş ortalama mikrograflar içeren sırasıyla otomatik olarak iki çıktı dizini yaratacaktır. 3. CTER: CTF'nin Defocus ve Astigmatizm Parametrelerini Tahmin Edin CTF parametrelerini (defocus ve astigmatiği, diğerleri kullanıcı tarafından ayarlanır) her doz-ağırlıksız ortalama mikrografı için tahmin edin. "CTER" simgesini ve ardından "CTF Tahmini" düğmesini tıklayın. "Giriş mikrografi yolu modeli" ayarlamak için, doz-ağırlıksız hareketle düzeltilmiş mikrografı seçin, ardından dosya adlarının değişken kısmını joker karakter ile değiştirin"*". Ayrıca, "Çıkış dizini" için yolu belirtin. "Genlik kontrastı" nı, rutin olarak kullanılan veri türünü (buz kalınlığı önemli bir faktördür) ve laboratuardaki mikroskop voltajını ( ör .% 10) ayarlayın. Tipik değerler% 7 – 14 aralığında 17'dir . Veri toplama sırasında kullanılan "Mikroskop küresel sapması (Cs)" ve "Mikroskop voltajı" ayarlayın. Sırasıyla CTF modeli için sırasıyla 0.0285 ve 0.285  -1 (40 – 4 Å) aralığındaki "en düşük frekans" ve "en yüksek frekans" arama aralığını ayarlayın. CTF parametrelerini tahmin etmek için "Çalıştır komutu" düğmesine basın. NOT: CTF parametreleri belirtilen çıktı dizinindeki partres.txt dosyasında otomatik olarak saklanır. 112 mikrografının CTF tahmini 96 çekirdek üzerinde hesaplandı ve temsili sonuçları elde etmek için kullanılan Linux kümesinde ~ 3 dakika sonra tamamlandı. 4. PENCERE: Doz Ağırlıklı Ortalama Mikrograflardan Parçacıkları Çıkarın E2boxer 6 ile mikrograflardan elle veya otomatik olarak parçacıkları seçin ve her biri ilişkili mikrograph içinde parçacık xy-koordinatlarının bir listesini içeren koordinat dosyaları oluşturun. "PENCEREYE" simgesini ve daha sonra "Parçacık Toplama" düğmesini tıklayın. E2boxer 6'yı başlatmak için "Çalıştır komutu" düğmesine basın ve her bir mikrografının parçacıklarını manuel veya otomatik olarak 18 seçin (bkz. Tartışma ). Her bir mikrografın son parçacık koordinatlarını EMAN1 dosya biçiminde (.box) saklayın. Alternatif olarak, koordinat dosyalarını EMAN1 formatına dönüştürdükten sonra diğer programlardan içe aktarın. Doz ağırlıklı mikrograflardan parçacık görüntüleri çıkararak parçacık yığınları oluşturun (SPHIRE'de parçacık yığınıEn "yığın" olarak adlandırılır). "Parçacık Ekstraksiyonu" düğmesine basın. Bir doz ağırlıklı hareketle düzeltilmiş mikrografı seçip değişken adını "*" joker karakteri ( ör. TcdA1 _ *. Mrc) ile değiştirerek "Giriş mikrografi yolu modeli" ni belirtin. Benzer şekilde, bir koordinat dosyası seçerek "Giriş koordinatları yolu modeli" ayarlayın ( örn. TcdA1 _ *. Kutu). "Çıkış dizini" için yolu belirtin. CTF parametre dosyasını (adım 3.1'de üretilen partres.txt) seçerek "CTF parametreleri kaynağı" ayarlayın. "Çalıştır komutu" düğmesine basın. Ayıklanan parçacık görüntü yığınlarını tek bir parçaya birleştirin. "Particle Stack" düğmesine tıklayın. BDB dosya yolu biçimini ("bdb: Parçacıklar / yığın" gibi) kullanarak "Çıktı sanal görüntü yığını" yolunu belirtin, burada "Parçacıklar" öğesininE dizini, her zaman EMAN2DB olan bir BDB veri tabanı dizini içerir ve "yığın", bu veritabanı içindeki belirli bir görüntü yığınını belirtir). "Mpi_proc" ile başlayan bir dizin seçip ardından dizin adlarının değişken kısmını "*" joker karakteri ile değiştirerek "BDB görüntü yığını deseni gir" seçeneğini belirtin ( ör. Parçacık / mpi_proc_000 – Parçacık / mpi_proc_ *). "Çalıştır komutu" düğmesine basın. 5. ISAC: Parçacık Görüntülerinin 2D'de Sınıflandırılması Parçacıkları hizalayarak ve 2D görünüşlerine göre kümeleyerek 2D sınıf ortalamalarını hesaplayın. NOT: Ortaya çıkan 2B ortalamalar, bireysel parçacık görüntülerine kıyasla gelişmiş bir sinyal-gürültü oranına (SNR) sahiptir ve bu nedenle, veri setinin kalitesini ve heterojenliğini görsel olarak değerlendirmek ve istifin istenmeyen görüntülerini sıralamak için kullanılır ( Örneğin, buz kristalleri, karbon kenarları,Agregalar, fragmanlar ve benzeri ) 19 . Dahası, daha sonra bir başlangıç ​​3D modelini belirlemek için kullanılacaktır. "ISAC" simgesini ve daha sonra "ISAC – 2D Clustering" düğmesini tıklayın. Ayıklanan parçacıkları içeren yığın dosyasını seçerek "Input image stack" seçeneğini seçin. "Çıkış dizini" için yolu belirtin. "Sınıf başına görüntüler" için 200 – 1000'i kullanın. Beklenen 2D sınıf sayısını dikkate alarak uygun sayıyı seçin (toplam parçacık sayısı, sınıf başına görüntü sayısına bölünür). SNR'ye ve veri kümesinin boyutuna bağlı olarak bu parametreyi ayarlayın. Veri kümesinin aşırı gürültülü olması durumunda sınıf başına üye sayısını artırın. Düşük partikül sayısı olduğunda sayıları azaltın. NOT: Bellek sınırlamaları nedeniyle oldukça büyük veri kümeleri (> 100.000 parçacıklar) için tam veri kümesini altkümelere bölün, bağımsız olarak her alt küme için ISAC gerçekleştirin ve birleştirinSonuçlar sonunda. Bu işleme senaryosu için ayrıntılı talimatlar http://www.sphire.mpg.de/wiki/doku.php adresinde verilmiştir. "Phase-flip" onay kutusunu işaretleyin. Tüm parçacık görüntülerini otomatik olarak bu ayarlarla küçülterek süreci hızlandırmak için "Hedef parçacık yarıçapı" ve "Hedef parçacık görüntüsü boyutu" için varsayılan değerleri saklayın. 2D sınıf ortalamalarını hesaplamak için "Çalıştır komutu" düğmesine basın. NOT: Bu adım hesaplama gerektiren bir işlem ve işlem süresi, hedef yarıçapı ve görüntü boyutu kadar parçacıkların ve sınıfların sayısıyla birlikte önemli ölçüde artmaktadır. 96 işlem içeren bir kümede ~ 10.000 parçacıkların 2D sınıflandırması yaklaşık 90 dakika sonra tamamlandı. Kalitelerinin tatmin edici olduğundan emin olmak için ortaya çıkan ISAC 2D ortalamalarını görüntüleyip görsel olarak inceleyin (bkz. Tartışma). "UYGULAMALAR" altındaki "Ekran Verileri" düğmesine basın. Set "; Giriş dosyaları "adım 5'de üretilen ISAC 2D ortalamalarını içeren dosyayı seçerek (class_averages.hdf)" Çalıştır komutu "düğmesine basarak ISAC tarafından verilen tekrarlanabilir ve doğrulanmış sınıf ortalamalarını görüntüleyin. Onaylanmış sınıf ortalamalarının sadece parçacık üyeleri dahil olmak üzere yeni bir yığın oluşturun. "Yığın Altını Oluştur" düğmesine basın. Adım 5.1.1'de olduğu gibi aynı yığın dosyasını seçerek "Input image stack" değerini ayarlayın. ISAC 2D ortalamalarını seçerek "ISAC ortalamaları" nı ayarlayın (adım 5.1'de üretilen class_averages.hdf). "Çıkış dizini" için yolu belirtin. "Çalıştır komutu" düğmesine basın. 6. VIPER: Başlangıçtaki 3B Modelini Hesapla Tüm kötü sınıf ortalamalarını ve parçacığın özdeş görünümlerini silerek (bkz. Tartışma) sınıf ortalamalarının küçük bir setini (≥100 görüntü) seçin ve bunları bir temsilci hesaplamak için kullanınVIPER kullanılarak oluşturulabilir başlangıçtaki model. Seçimin her biri ~ 200-500 üye olan en az 60-80 yüksek kaliteli ortalamayı içermesi gerektiğini unutmayın. "VIPER" simgesini ve ardından "Veri Göster" düğmesini tıklayın. ISAC 2D ortalamalarını seçerek "Giriş dosyaları" ayarlayın (adım 5.1'de üretilen class_averages.hdf). "Çalıştır komutu" düğmesine basın. E2displayın grafik penceresindeki bir yere farenin ortasındaki düğmeye basın ve açılan pencerede "DEL" düğmesini etkinleştirin. Tüm kötü sınıf ortalamalarını ve parçacığın özdeş görünümlerini silin (bkz. Tartışma ). Kalan 2D sınıf ortalamalarını yeni bir dosyaya kaydetmek için "Kaydet" düğmesine basın. Seçilen ISAC ortalamalarından sonraki 3B arıtma için bir başlangıç ​​referansı oluşturun. "Başlangıçtaki 3D Model – RVIPER" düğmesine tıklayın. Ekranlanmış sınıfı seçerek "Giriş görüntü yığını" ayarlayınOrtalamalar (adım 6.1'de üretilmiştir). "Çıkış dizini" için yolu belirtin. "Hedef partikül yarıçapı" için aynı değeri ISAC adımı 5.1.3 olarak kullandığınızdan emin olun. Tekrarlanabilir bir ab initio 3D modeli oluşturmak için "Çalıştır komutu" düğmesine basın. NOT: Bu adım hesaplama gerektiren bir işlem olup, sayı ortalamaları ve parçacıkların boyutu ile çalışma süresi önemli derecede artmaktadır. 96 işlemli bir kümede bu iş (~ 100 sınıf ortalamaları) ~ 15 dakika sonra bitti. Ortaya çıkan 3D modelin sınıf ortalamalarını ve ayrıca yapısal bütünlüğünü göz önüne alarak ( yani , parçalanmamış parçalar ve / veya yönsel eserler yoksa) makul olup olmadığını kontrol edin. Haritayı görüntülemek için Chimera 15 programını kullanın. Bu noktada homolog bir proteinin kristal yapısıyla veya ilgilenilen proteininin bir domainiyle ilk karşılaştırmasını yapın (eğer varsa), Temsil bölümünde gösterilmiştirNtatif Sonuçlar). Daha sonraki 3D iyileştirme için çevresindeki gürültüyü ortadan kaldırıp özgün piksel boyutuna uyacak şekilde yeniden ölçeklendirerek ab initio 3D modelinden bir başlangıç ​​3D referansını ve bir 3D maskesini üretin. "3D Referans Yarat" düğmesini tıklayın. Ab initio 3D modelini (adım 6.2'de üretilen average_volume.hdf) seçerek "Giriş hacmi" ni ayarlayın. "Çıkış dizini" için yolu belirtin. ISAC sıkıştırma oranı dosyasını (adım 5'te üretilen README_shrink_ratio.txt) seçerek "Tekrar örnekleme oranı kaynağı" ayarlayın. "Çalıştır komutu" düğmesine basın. BİR HEDİYE: Başlangıçtaki 3B Cildi Hassaslaştırın 3D hacmini ilk 3B modelinden başlayarak hassaslaştırın. "MERIDIEN" simgesini ve ardından "3D Ayrıntılandırması" düğmesini tıklayın. Sele tarafından "Giriş görüntüsü yığıtı" ve "Başlangıçtaki 3D referans" ayarlayınParçacık istifi ve ab initio 3D modeli (sırasıyla 5.3 ve 6.4 adımlarında üretilmiştir). "Çıkış dizini" için yolu belirtin. 3B maske dosyasını (6.4 adımında üretilen) seçerek "3D maske" ayarlayın. Her zaman bir 3D maske kullanın, ancak özellikle analizin erken bir safhasında, hatalı maskelemenin önyargısını önlemek için referansa gevşek şekilde takılmış küresel bir maske veya yumuşak kenarlı bir maske kullanın. "Sert 2D maskesini uygula" onay kutusunu işaretleyin. "Başlangıç ​​çözünürlüğü" nü, 20-25 A arasında bir kesme frekansı değerine ayarlayın. Başlangıç ​​modeli yanlılığını azaltmak için bu kesme frekanslı bir alçak geçiren filtrenin başlangıçtaki 3D yapısına uygulanacağını unutmayın. Bu işlem için kullanılan kümelenme özelliklerini kontrol edin ve sonra "Bellek başına bellek" değerini kullanılabilir bellekte gigabayt olarak ayarlayın. Başlangıçtaki 3D modelinden başlayarak tamamen otomatik bir şekilde 3B hacmini hassaslaştırmak için "Çalıştır komutu" düğmesine basın. <br /> NOT: Bu prosedür, veri setini iki yarıya bölecek, iki modeli bağımsız olarak hassaslaştıracak ve her biri parçacıkların sadece yarısından iki ham hacim verecektir. Hesaplamalı olarak talep ediliyor ve çalışma süresi parçacıkların sayısıyla önemli ölçüde artacaktır. Bu kümede, meridyen incelemesi, 192 işlemde (~ 8,000 parçacık, 352 kutu boyutu) çalışan 2.5 saat sonra tamamlandı. Sonradan bileme aşaması için rafine edilmiş hacimden yumuşak kenarlı bir 3D maske oluşturun. "Uyarlamalı 3D Maske" düğmesine tıklayın. Filtrelenmemiş yarı hacimden birini seçerek "Giriş hacmi" ayarlayın (adım 7.1'de üretilmiştir). "Çıktı maskesi" için yolu belirtin. "Binarizasyon eşiği" değerini ayarlayın. Bu belirli eşikte, gürültünün filtrelenmemiş yarım haritaların çözücü bölgedeki ilgi hacminin açıkça dışında olduğundan ve proteinin tüm yoğunluklarının hala c olduğundan emin olmak için Chimera kullanınBirbirlerine bağlı. Yumuşak kenar 3D maske oluşturmak için "Çalıştır komutu" düğmesine basın. NOT: Elde edilen maskenin ana gövdesi (değerleri> 0,5 olan voksellerden oluşur) parçacık yapısına sıkıca oturmalıdır, ancak yine de tüm yoğunlukları kapsar. Yumuşak kenar düşmesi en az 8-10 piksel genişliğinde olmalıdır. 3D arıtma ile elde edilen iki filtrelenmemiş hacmi birleştirme. Ardından, dedektörün modülasyon transfer fonksiyonuna (MTF), tahmini B faktörüne ve çözünürlük FSC (Fourier Shell Correlation) tahmine dayalı olarak güç spektrumunu ayarlayarak birleştirilmiş hacmi keskinleştirin. "Bileme" düğmesini seçin. Karşılık gelen dosyaları seçerek "İlk filtrelendirilmemiş yarım hacim" ve "İkinci filtre uygulanmamış yarım hacim" ayarlayın (adım 7.1'de üretilen vol_0_unfil.hdf ve vol_1_unfil.hdf). Her zaman "B faktörü arttırma" kullanın. Genellikle, varsayılan değerin eSon çözünürlük frekansı ve 10 A arasındaki aralığı kullanarak giriş veri setinden B-faktörü değerini ölçün. Alternatif olarak geçici bir değer belirtin ( ör. -100). FSC tabanlı bir filtre uygulamak için "Düşük geçiren filtre frekansı" için varsayılan değeri tutun. 3. adım maskesinde (adım 7.2'de üretilen) seçerek "Kullanıcı tarafından sağlanan maske" ayarlayın. Bildirilen çözünürlüğün bu maskeyle FSC'yi kullanarak belirleneceğini unutmayın. Rafine edilen 3D hacmi keskinleştirmek için "Çalıştır komutu" düğmesine basın. Yukarıdaki 3B arıtma adımıyla tahmin edilen tüm parçacıkların yansıtma yönlerinden 3B açısal dağılım haritası oluşturun. "Açısal Dağılım" düğmesine tıklayın. Dosyayı seçerek "Hizalama parametre dosyası" ayarlayın (adım 7.1'de üretilen final_params.txt) ve "Çalıştır komutu" düğmesine basın. Keskinleşmiş 3D modelini Chi kullanarak görsel olarak inceleyinmera. Elde edilen çözünürlük dikkate alındığında yapının makul gözüktüğünden emin olun (bkz. Tartışma ). Chimera'yı kullanarak açısal dağılımı görsel olarak inceleyin. Dağıtımın yaklaşık olarak tüm üç boyutlu açısal alanı kapsadığını doğrulayın. Simetrik yapılar için dağılımın eşsiz asimetrik üçgen içinde kısıtlandığını unutmayın. 8. SORT3D: 3B Heterojenliği Çok Değişken Bölgelere Odaklanarak Sıralama 3D arıtımda kullanılan parçacık yığınından 3D değişkenlik haritasını hesaplayın. "SORT3D" simgesini ve ardından "3B Değişkenlik Tahmini" düğmesini tıklayın. 3D arıtma adımı 7.1.1'e verilen aynı taranan parçacık yığınını seçerek "Giriş görüntüsü yığını" nı ayarlayın. "Çıkış dizini" için yolu belirtin. "Projeksiyon sayısı" için varsayılan değeri tutun. NOT: Köşe yazısının görüntüleriHer bir 3B projeksiyon açısında 2D varyansını tahmin etmek için kaput kullanılacaktır. Sayı ne kadar büyükse, tahmin daha az gürültülü olur, ancak çözünürlük ve dönme artifaktları o kadar düşük olur telaffuz edilir. "Use CTF" onay kutusunu işaretleyin. "Çalıştır komutu" düğmesine basın. Aşağıdaki 3B kümeleme aşaması için bir odak maskesi oluşturmak için 3B değişkenlik haritasını kullanın. "İkili 3B Maske" düğmesini seçin. 3B değişkenlik haritasını (adım 8.1'de üretilen) seçerek "Giriş hacmi" ni ayarlayın. "Çıktı maskesi" için dosya yolunu belirtin. Chimera'nın "Volume Viewer" içindeki "Level" alanının çıktısını kullanarak "Binarization threshold" değerini ayarlayın. "Çalıştır komutu" düğmesine basın. Yapısal olarak oldukça değişken bölgelere odaklanarak parçacık görüntülerini homojen yapısal gruplara ayırın. "3D Clustering – RSORT3D" düğmesine basın.3D arıtmanın çıktı dizini seçilerek (adım 7.1'de üretilen) "Giriş 3D arıtma dizini" ayarlayın. "Çıkış dizini" için yolu belirtin. Yumuşak kenarlı 3D maskesini (adım 7.2'de üretilen) seçerek "3D maske" ayarlayın. Binarized 3D değişkenlik haritasını (adım 8.2'de üretilen) seçerek "Focus 3D maske" ayarlayın. Büyük veri kümeleri için, "Grup başına görüntüler" için en az 5.000-10.000 kullanın. Programın daima grup başına görüntü sayısını bu ayardan daha düşük tuttuğunu unutmayın. Beklenen 3D grup sayısını (toplam parçacık sayısının "Grup başına görüntüler" değerine bölünmesi), veri kümesi, SNR ve heterojenlik derecesi dikkate alınarak değeri ayarlayın. Veri kümesindeki farklı yapısal durumların daha fazla olması beklenmedikçe yeterli sayıda parçacık varsa ~ 5-10 başlangıç ​​3D grupları ile başlayın. "En küçük grup boyutu" için en az 3.000-5.000 parçacık kullanın.Programın, "En küçük grup boyutu" ayarından daha düşük sayıda resim içeren grupları dikkate almayacağına dikkat edin. 3D kümeleme gerçekleştirmek için "Çalıştır komutu" düğmesine basın. NOT: RSORT3D iki basamağa bölünmüştür. İlk "sort3d" adımı, 3D heterojenliğini sıralar. Ardından, yukarıdaki 3B arıtma adımıyla belirlenen 3D hizalama parametrelerini kullanarak her homojen yapısal grubun hacimlerini yeniden oluşturur. İkinci "rsort3d" adımı, iki ayrı sıralama işleminin iki yönlü karşılaştırmasını yaparak, her grubun yeniden üretilebilir üyelerini bulur. Ardından homojen yapıları yalnızca tekrarlanabilir olarak atanan parçacıklar kullanarak yeniden yapılandırır. 96 çekirdekli bir kümede bu iş (~ 8,000 parçacık, 352 kutu boyutu) yaklaşık 3 saat sonra bitti. Program bittikten sonra homojen bir 3D grup seçmek için Chimera'yı kullanın. En belirgin çözünürlüğün yapısını seçin, genellikle en po ile ilişkilendirilirÇekici grup. Seçilen yapının, ilgilenilen proteinin 2D sınıf ortalamalarını ve biyolojik yönlerini dikkate alarak görsel olarak makul olduğundan emin olun (bkz. Tartışma ). Benzer çözünürlükte hemen hemen aynı yapıya sahip diğer ciltler varsa, bunları tek bir homojen 3D grubundan ortaya çıktığını düşünün. En homojen 3D grubun parçacık üyelerine (en yüksek çözünürlüğe) karşı yerel bir iyileştirme yapın. "Yerel Alt Kitle İncelt." Düğmesine tıklayın. Seçilen grubun parçacık kimliklerini içeren metin dosyasını seçerek "Alt metin metin dosyası yolu" nu ayarlayın ( örn., 8.3. Adımda üretilen Cluster0.txt). Önceki 3D ayrıntısının çıktı dizini seçilerek "adım arındırma dizini" ayarlayın (adım 7.1'de üretilmiştir). "Yinelemeyi yeniden başlatma" yı, önceki 3B inceliğinde en yüksek çözünürlüğe ulaşılana ayarlayın. Tuşuna basın.Seçilen partikül popülasyonunun yerel bir rafine edilmesi için "Komutu çalıştır" düğmesi. Aşama 7.2'ye benzer şekilde, yerel alt kümeler tarafından yeniden oluşturulmuş filtrelenmemiş bir nihai yarı hacimden yumuşak kenarlı bir 3D maske oluşturun. Adım 7.3'e benzer şekilde, yerel alt kümeler tarafından türetilen iki filtre uygulanmamış son yarı hacmi birleştirin ve birleştirilmiş hacmi keskinleştirin. Bununla birlikte, bu sefer keskinleştirilmiş sesi filtrelemeyin. NOT: Adım 8.4'teki heterojenite analizi, karşılaştırılabilir çözünürlükteki birkaç ayrı durumu belirtiyorsa, tüm farklı devletleri bağımsız olarak rafine etmek isteyebilirsiniz. 9. LOCALRES: Nihai 3B Cildin Yerel Çözünürlüğünü Tahmin Edin Homojen partikül kümesinden elde edilen 3B hacmin yerel çözünürlüğünü hesaplayın. "LOCALRES" ikonuna ve ardından "Local Resolution" butonuna tıklayın. "İlk yarı hacim" ve "İkinci yarı-volume "(8. adımda üretilen) yerel alt kümesinin filtrelenmemiş nihai yarı hacimlerini seçerek adım 8.6'da üretilen yumuşak kenarlı 3D maskesini seçerek" 3D maske "ayarlayın" Output volume "için dosya yolunu belirtin. . "FSC pencere boyutu" için varsayılan 7 piksel değerini koruyun. Bu ayarın, yerel-gerçek-alan korelasyonunun hesaplandığı pencerenin boyutunu tanımladığını unutmayın; Daha büyük pencere boyutları, yerel çözünürlük pahasına daha düzgün çözünürlük haritaları üretir. Çözünürlük kriteri için "Çözünürlük kesme" varsayılan değerini 0,5 tutun. NOT: Program, her bir voksel için yerel çözünürlüğü yerel FSC'nin seçilen çözünürlük eşiğinin altına düştüğü sıklık olarak raporlar. Daha düşük korelasyon değerlerinin yüksek istatistiksel belirsizliğe sahip olması nedeniyle, 0.5'in altındaki bir eşik önerilmez. Bu nedenle, ilgili yerel çözünürlük vokseller arasında kuvvetli bir şekilde değişecektir. "Overa içinLl çözünürlük "için, yerel altküm arıtımından sonra keskinleştirme konusunda tahmin edilen mutlak çözünürlüğü ayarlayın (adım 8.7). Birimin yerel çözünürlüğünü hesaplamak için" Çalıştır komutu "düğmesine basın. 3B yerel özünürlük haritasını kullanarak yerel alt kümes arıtımından sonra keskinleştirilen hacime 3B yerel filtre uygulayın. "3B Yerel Filtre" düğmesini tıklayın. Sivrilmiş ancak filtrelenmemiş 3D hacmi seçerek "Giriş hacmi" ayarlayın (adım 8.7'de üretilmiştir). Benzer şekilde, "Yerel çözünürlük dosyası" ve "3D maske" ayarlayın (sırasıyla adım 9.1 ve 8.6'da üretilmiştir). 3D maskesinin, yerel filtrelemenin uygulandığı bölgeyi tanımladığını unutmayın. "Çıktı hacmi" için dosya yolunu belirtin. 3D yerel filtreyi uygulamak için "Çalıştır komutu" düğmesine basın. Son 3B modelini ve 3B yerel çözünürlük haritasını görsel olarak incelemek için Chimera'yı kullanın (adım 9,2 ve 9'da üretilenler, respectively). 3D ses seviyesini yerel çözünürlüğe göre renklendirmek için "Yüzey rengi" seçeneğini seçin. Yerel çözünürlük dağılımının düzgün olması gerektiğini unutmayın (bkz. Tartışma ).

Representative Results

Yukarıda açıklanan protokol, Photorhabdus luminescens Tc kompleksinin (TcdA1) 20 , 21 , 22 A bileşeninin 112 direkt dedektör filminden başlayarak gerçekleştirildi . Bu veri seti, 300 kV'lik bir ivme voltajında ​​çalıştırılan, parlaklık dereceli bir alan emisyon tabancasına (XFEG) sahip bir Cs-düzeltilmiş elektron kriyo-mikroskopta kaydedildi. Görüntüler, numune ölçeğinde 1,14 Å'luk bir piksel boyutunda otomatik olarak toplam 60 e – / Â -2 dozuyla edinildi. Film çerçevelerinin hizalanmasından sonra ( Protokol Adım 2 ), elde edilen hareket düzeltilmiş ortalamalara yüksek çözünürlüklü izotropik Thon halkaları vardı ( Şekil 2a ). Bireysel parçacıklar kolayca görülebilir ve iyi ayrılmıştır ( Şekil 2b ). Parçacıklar daha sonra e2boxer'ın toplayıcı aracı kullanılarak toplandıLass = "xref"> 18 ( Protokol Adım 4.1 ). Bu durumda, daha seçici seçeneği kullanarak uygun bir eşik ayarlandı ( Şekil 2c ). 112 sayısal mikrografından 9,652 parçacık elde edildi. Çıkarılan görüntülerin çoğunluğu ( Protokol Adımı 4.2 ) iyi tanımlanmış parçacıklar içeriyordu ve kutu boyutu, önerilen şekilde partikül boyutunun ~ 1.5 kat daha büyüktü ( Şekil 2d ). Daha sonra, ISAC kullanarak, 2D heterojenite analizi yapıldı ( Protokol Adım 5 ). 98 sınıf ortalamasına ulaştı ( Şekil 3a ). Bu 2D sınıf ortalamalarını kullanarak, orta çözünürlükte VIPER ( Protokol Adımı 6 ) kullanılarak bir ab initio modeli hesaplandı ( Şekil 3b ). Bu model 3.9 Å çözünürlük 22 ( Şekil 3c ) daha önce çözülmüş TcdA1 kristal yapısı ile mükemmel bir uyum göstermektedir. Bu ab initio modeli ilk tem olarak kullanılmıştır Sadece 40.000 asimetrik birimden 3,5 A (0.143 kriter) yeniden yapılandırma ( Protokol Adımı 7 ) veren 3 boyutlu iyileştirme için (MERIDIEN) plakadır ( Şekil 4 ). Bu atom altı çözünürlük haritası, çoklu çekirdekten yararlanan iş akışının basamakları için 96 CPU'yu kullanarak 24 saat içinde elde edildi. 3B değişkenlik analizi için (Protokol adımı 8), adım 8.3.3'te ( yani başlangıçta 5 başlangıç ​​3D grupla başlar ) grup başına yalnızca 2.000 parçacık görüntüsü kullanılmış ve adım 8.3.4'teki en küçük grup boyutu için 200 görüntü elde edilmiştir. Az sayıda parçacık (~ 10.000). Analiz esas olarak, saflaştırmada kullanılan His etiketini içeren kompleksin N-terminal bölgesinde lokalize esneklik ortaya koydu ( Şekil 5a ). Aslında, oniki N-terminal kalıntısı ve His etiketi, daha önce yayınlanan TcdA1 kristal yapısında çözülmedi"22 ve bu muhtemelen düzensiz bölge muhtemelen esnekliği nedeniyle mevcut kriyo-EM yoğunluğunda çözülemedi ve reseptör bağlama alanlarında ve BC-bağlama alanlarında ilave değişkenlik tespit edildi ( Şekil 5a ). Yapının tatmin edici çözünürlüğü ve veri kümesinin oldukça küçük boyutu ile bu heterojenliğin tolere edilebilir olduğu kararlaştırıldı ve bu nedenle odaklanmış bir 3D sınıflandırma 23 gerçekleştirilmedi Son olarak, nihai yoğunluk haritasının yerel çözünürlüğü hesaplandı ( Protokol adımı 9.1, Şekil 5b ) ve keskinleştirilmiş 3D harita yerel olarak filtrelendi ( Protokol adımı 9.2) . Bu kalitede bir kalite, Coot 24 veya başka bir arıtma aracı kullanarak de novo model oluşturma için kullanılabilir ( Şekil 6 ). <Strong> Şekil 1: SPHIRE kullanan görüntü işleme. ( A ) SPHIRE yazılım paketinin GUI'si. İş akışının belirli bir adımı, GUI'nin solundaki ilgili piktogramı seçerek etkinleştirilebilir ("iş akışı basamağı"). İş akışının bu adımı ile ilişkili komutlar ve yardımcı programlar GUI'nin merkezi alanında görünecektir. Komutlardan birini seçtikten sonra ilgili parametreler GUI'nin sağında gösterilir. Gelişmiş parametreler genellikle varsayılan varsayılan değerlerin değiştirilmesini gerektirmez. ( B ) SPHIRE GUI'yi kullanarak tek parçacık görüntü işlemenin iş akışındaki aşamalar. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 2: Hareket Düzeltmesi ve PartikülLe Çıkarma. ( A , b ) 1.7 μm'lik bir odaksızlıkta kaydedilen, tipik, yüksek kalitede, düşük dozda, sürüklenerek düzeltilmiş dijital mikrograf. Güç tayfında (a) 2.7 A çözünürlüğüne uzanan izotropik Thon halkaları ve 2D görüntüde ( b ) görülebilen parçacıklara dikkat edin. ( C ) E2boks kullanarak tanecik seçimi. Yeşil daireler seçilen parçacıkları gösterir. ( D ) Doz ağırlıklı mikrografından çıkarılan tipik ham parçacıklar. Ölçek çubukları = 20 nm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 3: 2D Kümeleme ve İlk Model Üretimi. ( A ) 2D sınıf ortalamalarının galerisi, çoğunluk, yan görüşleri temsil etmektedir o Parçacık. Ölçek çubuğu = 20 nm. ( B ) Referanssız sınıf ortalamalarından RVIPER kullanılarak elde edilen TcdA1'in Ab initio 3D haritası. ( C ) TcdA1 kristal yapısının (kurdele) (pdb-id 1VW1) ilk cryo-EM yoğunluğuna (şeffaf gri) rijit gövde uydurma. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 4: TcdA1'in Cryo-EM 3D Yapısı. ( A , b ) ~ 9,500 parçacık görüntüleri kullanılarak hesaplanan TcdA1'in son 3.5 Â yoğunluk haritası: ( a ) yan ve ( b ) üstten görünüş. ( C ) Bir α-helezon ve bir β-tabakası için kriyo-EM yoğunluğunun temsili alanları.Arge.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir versiyon görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 5: Değişkenlik Analizi ve Yerel Çözünürlük. ( A ) Bıçaklanmış TcdA1 cryo-EM haritasının (gri) yüzeyi ve değişkenlik haritası (yeşil). Daha iyi netlik için değişkenlik haritası, 30A'ya düşük geçirimli filtrelendi. ( B ) TcdA1 bilenmiş cryo-EM haritasının yerel çözünürlüğüne (Å) göre renklendirilmesi. Değişkenliği yüksek alanlar ve düşük yerel çözünürlük arasındaki topolojik anlaşmayı not edin. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. Şekil 6: 3D ModCoot kullanarak TcdA1'in el Yapımı. Cryo-EM yoğunluğunun temsil ettiği bölgeler ve atomik model, bir α-heliks için gösterilir. Atom modeli Coot'u kullanarak yeni inşa edildi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Tek parçacıklı cryo-EM, son yıllarda hızlı bir gelişme göstermiş ve büyük biyolojik önemi olan makromoleküler komplekslerin sayısız atomik çözünürlük yapıları üretmiştir25. Şu anda sahaya giren çok sayıda acemi kullanıcısını desteklemek için tek parçacıklı görüntü analiz platformu SPHIRE'yi geliştirdik ve burada film hizalama, parçacık toplama, CTF tahmini, başlangıç ​​modeli dahil olmak üzere tüm iş akışları için bir walk-through protokolü sunduk Hesaplama, 2D ve 3D heterojenite analizi, yüksek çözünürlüklü 3D iyileştirme ve yerel çözünürlük tahmini ve filtreleme.

Burada açıklanan protokol, ilgilenilen proteinin cryo-EM mikrograflarını kullanarak ve SPHIRE'nin tek başına GUI tarafından sağlanan hesaplama araçlarının yardımıyla, 3B yapı tayini için kısa bir rehber olarak tasarlanmıştır.

İş akışının en önemli özelliği,Prosedürlerin tekrarlanabilirlik 19 ile geçerlilik kavramına dayandığı ve parametre ayarlamasına ihtiyaç duymadığı için yalnızca bir kez çalıştırılması gerekir. Bu otomatik validasyon mekanizması, SPHERE'nin diğer yazılım paketlerine kıyasla önemli bir avantajıdır; çünkü sonuçlar, nesnel olabilmeleri ve çoğaltılabilir olmaları ve daha da önemlisi, kabul edilebilir bir hesaplama maliyetiyle elde edilebilir olma eğilimindedirler. Boru hattı ayrıca deneyimli kullanıcılar için kendi yöntemleriyle bağımsız bağımsız doğrulama ve değerlendirme yapmak için zengin bir teşhis bilgisi sağlar. Yine de, yapısal biyoloji ve elektron mikroskobunda en azından temel teorik altyapıya sahip olan bir acemi kullanıcı, kendi verileri ve otomatik validasyon prosedürleri kullanarak atom-altı çözünürlük yapıları elde edebilmelidir.

Bununla birlikte, atom-altı bir çözünürlük yapısının elde edilmesi her zaman açık değildir ve sonuç, numunenin kalitesine ve giriş verilerine bağlıdıra. Burada sunulan prosedürler için, yeterli sayıda homojen ve rastgele yönlendirilmiş tek parçacıklar gösteren ortalama yüksek kaliteli, hizalanmamış ham EM filmleri bulunduğunu varsaymaktadır. Genel olarak, simetri, boyut veya molekülün genel şekli ile ilgili herhangi bir kısıtlama yoktur, ancak düşük moleküler ağırlık, özellikle protein şekilsiz küresel şekle sahip olduğunda, sınırlayıcı bir faktör olabilir. Genellikle, yüksek nokta grubu simetrisi ile daha büyük, iyi düzenlenmiş parçacıkların analizi daha az talep gerektirir. Bu nedenle acemi kullanıcıların mevcut protokolü önce iyi karakterize edilmiş bir cryo-EM veri setiyle çalıştırmaları kesinlikle önerilir. Ya SPHIRE öğretici veriler (http: /sphire.mpg.de) veya ham filmlerle EMPIAR tarafından sunulan veri kümelerinden (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) biri iyi bir başlangıç ​​noktasıdır .

Kendi verilerinizi işlerken, bazı veri kümelerinin veya bazı resimlerin bazı quali'yi karşılamayacağı muhtemeldirKriterleri. Bu bağlamda, iş akışının büyük adımları için program tarafından gerçekleştirilen otomatik kararlılık ve tekrarlanabilirlik kontrollerine ek olarak, kullanıcıların protokolün belirli "kontrol noktalarında" sonuçlarını görsel olarak incelemesi önerilir, özellikle de son yeniden yapılanma Tatmin edici değil.

İlk görsel muayene, film hizalamasından ( Protokol adımı 2 ) ve CTF tahmini sonrasında ( protokol adım 3 ) mikrograf düzleminde yapılabilir. Ortaya çıkan hareket düzeltilmiş ortalamalar açıkça ayırt edilebilir ve iyi ayrılmış tek parçacıklar göstermeli ve güç tayfları açıkça görülebilir, izotropik Thon halkaları göstermelidir. Görünür oldukları mekansal frekans, çoğu durumda, yapının ilke olarak nihai olarak belirleyebileceği en yüksek çözünürlüğü tanımlar. Hareket düzeltilmiş yeterli kalitede ve güç tayfı ortalamasına örnekler,34; Temsilcilik Sonuçları "Son sonuca olumsuz etkisi olabilecek outlier görüntüler, SPHIRE'nin Drift ve CTF değerlendirme GUI araçlarıyla (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php) kaldırılabilir.

Parçacık taramasıyla ilgili olarak, SPHIRE boru hattındaki önemli adım, ISAC'yi kullanarak 2D sınıflandırmadır ( Protokol Adımı 5.2) . Burada, kullanıcı, program tarafından otomatik olarak tanımlanan yeniden üretilebilir 2D sınıf ortalamalarının, açısal alanı tamamen eşit şekilde örtmek için yeterli bir oryantasyon aralığını benimsemesini kontrol etmelidir. Sınıf ortalamaları kalitesi tatmin edici değilse (gürültülü ve / veya bulanık görüntüler) ve / veya tekrarlanabilir sınıf ortalamaları çok düşükse, otomatik toplama kalitesini iyileştirmeyi, veri kümesi görüntülemeyi veya örnek hazırlamayı optimize etmeyi düşünün. Çoğu durumda, iyi bir 2D sınıf ortalamaları sağlamayan bir veri kümesinden güvenilir bir yeniden yapılandırma hesaplamak mümkün değildir. Yüksek kaliteli 2D sınıf ave örnekleri"Temsilci Sonuçlar" bölümünde gösterilmektedir.

RVIPER kullanarak otomatik bir şekilde güvenilir bir başlangıç ​​3D modeli elde etmek için en az 100 sınıf ortalaması gereklidir ( Protokol Adımı 6.1 ). Bu adım için, kullanıcı en yüksek kalitede ortalamaları seçmeli ve parçacığın mümkün olduğunca çok yönünü içermelidir. İlk modelin kalitesi, sonraki yüksek çözünürlüklü 3D iyileştirmenin başarısı için kritik önem taşıyor.

Diğer yazılım paketlerinde, "kötü" parçacıkları 8 , 9 kaldırmak için bazen 3D sınıflandırma yapılır. Bununla birlikte, SPHIRE'de bu parçacıkların çoğu, ISAC kullanılarak 2D sınıflandırma sırasında otomatik olarak elimine edilir. Bu nedenle, 3D sıralama işleminin yoğun bir adımını gerçekleştirmek için yeniden yapılandırma ve 3D değişkenlik analizi, veri kümesinin heterojenliğini gösteriyorsa önerilir.

En önemlisi, kullanıcı her zaman ortaya çıkan 3B birimlerini dikkatli bir şekilde dikkatlice kontrol etmeli ( Protokol adımı 9.3 ) ve ilgili yoğunluğun özelliklerinin nominal çözünürlük ile iyi uyduğunu onaylamalıdır. <9Å çözünürlüğünde, α-helislere karşılık gelen çubuk benzeri yoğunluklar görülebilir hale gelir. <4.5 Å çözünürlükte, β-tabakalarındaki ipliklere karşılık gelen yoğunluklar normalde iyi ayrılır ve hacimli amino asitler görünür hale gelir. Yüksek çözünürlüklü bir harita (<3 Å) açıkça görülebilir yan zincirler göstermeli ve böylece doğru bir atom modelinin oluşturulmasına izin verilmelidir.

Bugüne kadar elde edilen sonuçlar, SPHERE'nin otomatik tekrarlanabilirlik testleri ve minimal görsel incelemelerin yardımıyla, mevcut protokolün her türden tek parçacıklı cryo-EM projesine uygulanabileceğini göstermektedir. Her işleme adımının temsili sonuçları, TcdA1 toksininin yeniden yapılandırılması için gösterilir.Photorhabdus luminescens 21 , atomik çözünürlük yakınında çözülmüştür. Benzer nitelikteki yoğunluk haritaları, de novo omurga izlemenin yanı sıra karşılıklı veya gerçek uzay arıtma yöntemiyle güvenilir atom modelleri oluşturmak ve böylece karmaşık moleküler mekanizmaların anlaşılması için sağlam bir yapısal çerçeve sağlamak için kullanılabilir.

ACCESION KODLARI:

EM yapısının ve işlenmemiş filmlerin koordinatları sırasıyla EMD-3645 ve EMPIAR-10089 erişim numaraları altında Elektron Mikroskopisi Veri Bankası'na ve Elektron Mikroskopisi Pilot Görüntü Arşivi'ne yatırıldı.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bize TcdA1 mikrografları sağladığı için D. Roderer'a teşekkür ediyoruz. Steven Ludtke'ye EMAN2 altyapısının devam eden desteği için teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Max Planck Topluluğu'ndan (SR'ye) ve Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7 / 2007-2013) (615984 no'lu hibeye kadar) Avrupa Konseyi'ne (SR'ye) ve Ulusal Enstitülerden Sağlık R01 GM60635 ila PAP).

Materials

SPHIRE Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund  and Houston Medical School, Houston, Texas  http://sphire.mpg.de
UCSF Chimera University of California, San Francisco http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/
Unblur Janelia Farm Research Campus, Ashburn http://grigoriefflab.janelia.org/unblur
Coot MRC Laboratory of Molecular Biology,  Cambridge http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/
EMAN2 Baylor College of Medicine, Houston http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2
Computing Cluster with 1824 cores Max Planck Institute of Molecular Physiology Linux Cluster with 76  nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM
TITAN KRIOS electron microscope  FEI 300 kV, Cs correction, XFEG
Falcon II direct electron detector FEI
EPU (automated data acquisition software) FEI https://www.fei.com/software/epu/
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nogales, E. The development of cryo-EM into a mainstream structural biology technique. Nature Methods. 13 (1), 24-27 (2016).
  2. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  3. Bai, X. -. C., Yan, C., et al. An atomic structure of human γ-secretase. Nature. 525 (7568), 212-217 (2015).
  4. Ecken, J. V. D., Heissler, S. M., Pathan-Chhatbar, S., Manstein, D. J., Raunser, S. Cryo-EM structure of a human cytoplasmic actomyosin complex at near-atomic resolution. Nature. 534 (7609), 724-728 (2016).
  5. von der Ecken, J., Müller, M., Lehman, W., Manstein, D. J., Penczek, P. A., Raunser, S. Structure of the F-actin-tropomyosin complex. Nature. 519 (7541), 114-117 (2015).
  6. Tang, G., Peng, L., et al. EMAN2: An extensible image processing suite for electron microscopy. Journal of Structural Biology. 157 (1), 38-46 (2007).
  7. van Heel, M., Harauz, G., Orlova, E. V., Schmidt, R., Schatz, M. A new generation of the IMAGIC image processing system. Journal of Structural Biology. 116 (1), 17-24 (1996).
  8. Grigorieff, N. FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures. Journal of Structural Biology. 157 (1), 117-125 (2007).
  9. Scheres, S. H. W. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. Journal of Structural Biology. 180 (3), 519-530 (2012).
  10. Shaikh, T. R., Gao, H., et al. SPIDER image processing for single-particle reconstruction of biological macromolecules from electron micrographs. Nature Protocols. 3 (12), 1941-1974 (2008).
  11. Hohn, M., Tang, G., et al. SPARX, a new environment for Cryo-EM image processing. Journal of Structural Biology. 157 (1), 47-55 (2007).
  12. Lander, G. C., Stagg, S. M., et al. Appion: an integrated, database-driven pipeline to facilitate EM image processing. Journal of Structural Biology. 166 (1), 95-102 (2009).
  13. de la Rosa-Trevìn, J. M., Quintana, A., et al. Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy. Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).
  14. Grant, T., Grigorieff, N. Measuring the optimal exposure for single particle cryo-EM using a 2.6 Å reconstruction of rotavirus VP6. eLife. 4, 06980 (2015).
  15. Pettersen, E. F., Goddard, T. D., et al. UCSF Chimera?A visualization system for exploratory research and analysis. Journal of Computational Chemistry. 25 (13), 1605-1612 (2004).
  16. Penczek, P. A., Fang, J., Li, X., Cheng, Y., Loerke, J., Spahn, C. M. T. CTER-rapid estimation of CTF parameters with error assessment. Ultramicroscopy. 140, 9-19 (2014).
  17. Frank, J. . Three-Dimensional Electron Microscopy of Macromolecular Assemblies. , (2006).
  18. Woolford, D., Ericksson, G., et al. SwarmPS: rapid, semi-automated single particle selection software. Journal of Structural Biology. 157 (1), 174-188 (2007).
  19. Yang, Z., Fang, J., Chittuluru, J., Asturias, F. J., Penczek, P. A. Iterative Stable Alignment and Clustering of 2D Transmission Electron Microscope Images. Structure/Folding and Design. 20 (2), 237-247 (2012).
  20. Gatsogiannis, C., Merino, F., et al. Membrane insertion of a Tc toxin in near-atomic detail. Nature Publishing Group. , (2016).
  21. Gatsogiannis, C., Lang, A. E., et al. A syringe-like injection mechanism in Photorhabdus luminescens toxins. Nature. 495 (7442), 520-523 (2013).
  22. Meusch, D., Gatsogiannis, C., et al. Mechanism of Tc toxin action revealed in molecular detail. Nature. 508 (7494), 61-65 (2014).
  23. Penczek, P. A., Frank, J., Spahn, C. M. T. A method of focused classification, based on the bootstrap 3D variance analysis, and its application to EF-G-dependent translocation. Journal of Structural Biology. 154 (2), 184-194 (2006).
  24. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 66, 486-501 (2010).
  25. Callaway, E. The revolution will not be crystallized: a new method sweeps through structural biology. Nature. 525 (7568), 172-174 (2015).

Tags

Single Particle AnalysisElectron Cryo-microscopySPHIREMacromolecular ComplexesHigh-resolution Cryo-EMParticle Box SizeCTF EstimationMotion CorrectionDose-weightedDose-unweightedParticle Picking

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Moriya, T., Saur, M., Stabrin, M., Merino, F., Voicu, H., Huang, Z., Penczek, P. A., Raunser, S., Gatsogiannis, C. High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE. J. Vis. Exp. (123), e55448, doi:10.3791/55448 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image