Hochauflösende Einzelteilchenanalyse aus Elektronen-Kryomikroskopie-Bildern mit SPHIRE
Summary
Dieses Papier stellt ein Protokoll für die Verarbeitung von Kryo-EM-Bildern mit der Software-Suite SPHIRE vor. Das vorliegende Protokoll kann für fast alle Einzelteilchen-EM-Projekte angewendet werden, die auf eine nahezu atomare Auflösung abzielen.
Abstract
SPHIRE (SPARX für hochauflösende Elektronenmikroskopie) ist eine neuartige, offene, bedienerfreundliche Software-Suite für die halbautomatisierte Verarbeitung von Single-Partikel-Elektronen-Kryomikroskopie (Cryo-EM) Daten. Das hier vorgestellte Protokoll beschreibt ausführlich, wie man eine nahezu atomare Auflösungsstruktur ab Kryo-EM-Mikrograph-Filmen erhält, indem er die Benutzer durch alle Schritte der Einzelteilchenstruktur-Bestimmungs-Pipeline führt. Diese Schritte werden von der neuen grafischen Benutzeroberfläche von SPHIRE gesteuert und erfordern einen minimalen Eingriff des Benutzers. Unter Verwendung dieses Protokolls wurde eine 3,5 Å-Struktur von TcdA1, ein Tc-Toxin-Komplex aus Photorhabdus-Lumineszenen , von nur 9500 Einzelteilchen abgeleitet. Dieser stromlinienförmige Ansatz hilft Anfängern ohne umfangreiche Verarbeitungserfahrung und a priori strukturelle Informationen, um geräuscharme und unvoreingenommene Atommodelle ihrer gereinigten makromolekularen Komplexe in ihrem Heimatzustand zu erhalten.
Introduction
Nach der Entwicklung der direkten Elektronendetektortechnologie setzt der bemerkenswerte Fortschritt bei Einzelteilchen-Kryo-EM derzeit die Strukturbiologie um 1 . Im Vergleich zur Röntgenkristallographie erfordert diese Technik nur eine geringe Menge an Proteinmaterial ohne die Notwendigkeit einer Kristallisation, während sie gleichzeitig weniger Beschränkungen hinsichtlich der Reinheit der Probe aufwirft und die Bestimmung von Strukturen bei nahezu atomarer Auflösung ermöglicht. Wichtig ist, dass verschiedene Kompositionen oder Zustände nun rechnerisch getrennt werden können und die Strukturbestimmung der verschiedenen Konformationen mit beispiellosem Detaillierungsgrad durchgeführt werden kann. In jüngster Zeit konnten Dichtekarten von anspruchsvollen Molekülen bei Auflösungen erzeugt werden, die ein de novo Modellbau und damit ein tiefes Verständnis ihrer Wirkungsweise 2 , 3 , 4 , 5 ermöglichen.
Eine Vielzahl von Bildverarbeitungs-Softwarepaketen gibt es in der 3DEM (3D Electron Microscopy) Community (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy) und die meisten von ihnen sind kontinuierlich weiterentwickelt. Für Proteine, die verschiedene Molekulargewichte und Symmetrien mit verschiedenen Softwarepaketen aufweisen, wie EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 und SPARX 11 , wurde eine nahezu atomare Auflösung erreicht. Jedes Paket erfordert ein anderes Niveau der Benutzer-Know-how und bietet eine andere Ebene der Benutzerführung, Automatisierung und Erweiterbarkeit. Darüber hinaus, während einige Programme komplette Umgebungen zur Erleichterung aller Schritte der Bildanalyse, andere sind entworfen, um bestimmte Aufgaben zu optimieren, wie die Verfeinerung von Ausrichtungsparametern ausgehend von einem bekannten rEferenzstruktur In jüngerer Zeit wurden mehrere Plattformen entwickelt, darunter APPION 12 und SCIPION 13 , die eine einzige Verarbeitungspipeline bereitstellen, die Ansätze und Protokolle aus den oben aufgeführten Softwarepaketen integriert.
Um zur aktuellen Entwicklung von cryo-EM beizutragen, wurde SPARX zu einer neuen eigenständigen und kompletten Plattform für die Einzelpartikelanalyse, genannt SPHIRE (SPARX für hochauflösende Elektronenmikroskopie), neu entwickelt. Um die Erreichbarkeit der Technik für neue Forscher auf dem Gebiet zu erhöhen und die große Menge an Daten, die von modernen vollautomatischen High-End-Elektronenmikroskopen produziert werden, zu bewältigen, wurde die Verarbeitungspipeline neu gestaltet und durch die Einführung einer einfach zu bedienenden Lösung vereinfacht Grafische Benutzeroberfläche (GUI) und Automatisierung der wichtigsten Schritte des Workflows. Darüber hinaus wurden neue Algorithmen hinzugefügt, um eine schnelle, reproduzierbare und automatisierte Strukturbestimmung von cr zu ermöglichenYo-EM Bilder. Darüber hinaus wurde eine Validierung durch Reproduzierbarkeit eingeführt, um gemeinsame Artefakte zu vermeiden, die während der Verfeinerung und Heterogenitätsanalyse erzeugt wurden.
Obwohl das Programm weitgehend modifiziert wurde, wurden seine geschätzten Kernmerkmale beibehalten: ein einfacher Open-Source-Code, das moderne objektorientierte Design und die Python-Schnittstellen für alle Basisfunktionen. So wurde es nicht in ein Black-Box-Programm geändert, so dass Benutzer den Python-Code studieren und einfach modifizieren, zusätzliche Anwendungen erstellen oder den gesamten Workflow ändern können. Dies ist besonders nützlich für Nicht-Standard-Kryo-EM-Projekte.
Hier stellen wir ein Protokoll zur Erlangung einer nahezu atomaren Auflösungsdichtekarte aus Kryo-EM-Bildern unter Verwendung der GUI von SPHIRE vor. Es beschreibt im Detail alle Schritte, die erforderlich sind, um eine Dichtekarte aus rohen Kryo-EM-Direktdetektorfilmen zu erzeugen, und ist nicht auf einen bestimmten Makromolekültyp beschränkt. Dieses Protokoll beabsichtigt vor allem, newc zu führenOmers im Feld durch den Workflow und liefern wichtige Informationen über entscheidende Schritte der Verarbeitung sowie einige der möglichen Fallstricke und Hindernisse. Weitergehende Funktionen und der theoretische Hintergrund hinter SPHIRE werden an anderer Stelle beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Single-Partikel-Kryo-EM hat in den letzten Jahren eine rasche Entwicklung gezeigt und zahlreiche atomare Auflösungsstrukturen von makromolekularen Komplexen mit großer biologischer Bedeutung 25 geliefert. Um die große Anzahl von Anfängern, die gerade in das Feld einsteigen, zu unterstützen, haben wir die Single-Partikel- Bildanalyse-Plattform SPHIRE entwickelt und präsentieren hier ein Walk-Through-Protokoll für den gesamten Workflow inklusive Filmausrichtung, Partikelkommissionierung, CTF-Schätzung, Erstmodell Berechnung, 2D- und 3D-Heterogenitätsanalyse, hochauflösende 3D-Verfeinerung und lokale Schätzung und Filterung.
Das hier beschriebene Protokoll dient als Kurzanleitung zur 3D-Strukturbestimmung unter Verwendung von Kryo-EM-Mikrophotographien des interessierenden Proteins und mit Hilfe von Rechenwerkzeugen, die von der eigenständigen GUI von SPHIRE bereitgestellt werden.
Das Hauptmerkmal des Workflows ist, dass die meistenDer Prozeduren müssen nur einmal ausgeführt werden, da sie sich auf das Konzept der Validierung durch Reproduzierbarkeit 19 verlassen und keine Parameter-Optimierung erfordern. Dieser automatische Validierungsmechanismus ist ein Hauptvorteil von SPHIRE gegenüber anderen Softwarepaketen, da die Ergebnisse sowohl objektiv als auch reproduzierbar sind und vor allem zu einem akzeptablen Rechenaufwand erhältlich sind. Die Pipeline bietet darüber hinaus eine Fülle von Diagnoseinformationen für erfahrene Anwender, um eine unabhängige Validierung und Bewertung mit eigenen Methoden durchzuführen. Dennoch sollte ein Anfänger, der zumindest einen elementaren theoretischen Hintergrund in der Strukturbiologie und der Elektronenmikroskopie hat, nahezu atomare Auflösungsstrukturen mit eigenen Daten und den automatisierten Validierungsverfahren erhalten können.
Jedoch ist das Erhalten einer nahezu atomaren Auflösungsstruktur nicht immer einfach und das Ergebnis hängt stark von der Qualität der Probe und der Eingabe abein. Für die hier vorgestellten Verfahren wird davon ausgegangen, dass eine ausreichende Anzahl von hochwertigen, nicht ausgerichteten Roh-EM-Filmen zur Verfügung steht, deren Mittelwerte deutlich erkennbare homogene und zufällig orientierte Einzelpartikel aufweisen. Im Allgemeinen gibt es keine Beschränkungen hinsichtlich Symmetrie, Größe oder Gesamtform des Moleküls, aber ein niedriges Molekulargewicht kann ein limitierender Faktor sein, insbesondere wenn das Protein eine charakteristische globuläre Form aufweist. In der Regel ist die Analyse größerer, gut geordneter Partikel mit hoher Punktgruppen-Symmetrie weniger anspruchsvoll. Daher empfiehlt es sich für Anfänger, das aktuelle Protokoll zunächst mit einem gut charakterisierten Kryo-EM-Datensatz zu betreiben. Entweder sind die SPHIRE-Tutorialdaten (http: /sphire.mpg.de) oder einer der EMPIAR eingereichten Datensätze (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) mit rohen Filmen ein guter Ausgangspunkt .
Bei der Verarbeitung eigener Daten ist es sehr wahrscheinlich, dass einige Datensätze oder einige der Bilder bestimmte Quali nicht erfüllenKriterien. In diesem Zusammenhang empfiehlt es sich neben den automatisierten Stabilitäts- und Reproduzierbarkeitsprüfungen, die das Programm für wichtige Schritte des Workflows durchführt, den Nutzern weiterhin, die Ergebnisse bei bestimmten "Checkpoints" des Protokolls visuell zu untersuchen, insbesondere wenn die endgültige Rekonstruktion erfolgt Ist nicht zufriedenstellend.
Die erste visuelle Inspektion kann auf der mikroskopischen Ebene nach der Filmausrichtung (Protokollschritt 2 ) und der CTF-Schätzung durchgeführt werden (Protokollschritt 3 ). Die daraus resultierenden bewegungskorrigierten Mittelwerte sollten deutlich erkennbare und gut getrennte Einzelteilchen zeigen und ihre Leistungsspektren sollen deutlich erkennbare, isotrope Thonringe zeigen. Die räumliche Häufigkeit, zu der sie sichtbar sind, definiert in den meisten Fällen die höchste Auflösung, auf die die Struktur grundsätzlich letztlich bestimmt werden kann. Beispiele für einen bewegungskorrigierten Durchschnitt von ausreichender Qualität und sein Leistungsspektrum sind im Abschnitt & #34. Repräsentative Ergebnisse "Ausreichende Bilder, die sich negativ auf das Endergebnis auswirken könnten, können mit Hilfe von SPHIRE Drift- und CTF-Assessment-GUI-Tools (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php) entfernt werden.
Im Hinblick auf die Partikel-Screening ist der entscheidende Schritt in der SPHIRE-Pipeline die 2D-Klassifikation mit ISAC (Protokoll Schritt 5.2) . Hier sollte der Benutzer kontrollieren, dass die reproduzierbaren 2D-Klasse-Mittelwerte, die automatisch vom Programm identifiziert werden, eine Reihe von Orientierungen annehmen, die ausreichen, um den Winkelraum quasi gleichmäßig zu decken. Wenn die Qualität der Klassenmittelwerte nicht zufriedenstellend ist (geräuschvolle und / oder verschwommene Bilder) und / oder die Anzahl der reproduzierbaren Klassenmittelwerte sehr gering ist, sollten Sie die automatische Kommissionierqualität verbessern, die Dataset-Bildgebung oder die Probenvorbereitung optimieren. In den meisten Fällen ist es nicht möglich, eine zuverlässige Rekonstruktion aus einem Datensatz zu berechnen, der keine guten 2D-Klassenmittelwerte ergibt. Beispiele für hochwertige 2D Klasse aveWut sind im Abschnitt "Repräsentative Ergebnisse" dargestellt.
Mindestens 100 Klassenmittelwerte sind erforderlich, um ein zuverlässiges Anfangs-3D-Modell mit Hilfe von RVIPER automatisiert zu erhalten (Protokoll Schritt 6.1 ). Für diesen Schritt sollte der Benutzer die Mittelwerte mit der höchsten Qualität auswählen und möglichst viele unterschiedliche Orientierungen des Teilchens enthalten. Die Qualität des Erstmodells ist entscheidend für den Erfolg der nachfolgenden hochauflösenden 3D-Verfeinerung.
In anderen Softwarepaketen wird manchmal die 3D-Klassifikation durchgeführt, um "schlechte" Partikel 8 , 9 zu entfernen. Allerdings werden bei SPHIRE die meisten dieser Partikel bereits bei der 2D-Klassifikation mit ISAC automatisch eliminiert. So empfiehlt es sich, den rechenintensiven Schritt der 3D-Sortierung nur dann durchzuführen, wenn die Rekonstruktion und die 3D-Variabilitätsanalyse die Heterogenität des Datensatzes anzeigen.
Am wichtigsten ist, dass der Benutzer die daraus resultierenden 3D-Bände sorgfältig sorgfältig inspizieren muss (Protokoll Schritt 9.3 ) und bestätigen, dass sich die Merkmale der jeweiligen Dichte mit der nominalen Auflösung gut übereinstimmen. Bei einer Auflösung von <9 Å werden stabförmige Dichten, die α-Helices entsprechen, sichtbar. Bei einer Auflösung <4,5 Å sind Dichten, die Strängen in β-Blättern entsprechen, normalerweise gut getrennt und sperrige Aminosäuren werden sichtbar. Eine hochauflösende Karte (<3 Å) sollte deutlich erkennbare Seitenketten zeigen, so dass ein genaues Atommodell aufgebaut werden kann.
Die bisherigen Ergebnisse zeigen, dass mit Hilfe der automatischen Reproduzierbarkeitstests von SPHIRE und der minimalen visuellen Inspektionen das vorliegende Protokoll allgemein für jede Art von Einzelteilchen-Kryo-EM-Projekt anwendbar ist. Repräsentative Ergebnisse jedes Verarbeitungsschritts sind für die Rekonstruktion des TcdA1-Toxins von dargestelltPhotorhabdus luminescens 21 , die in nahezu atomare Auflösung gelöst wurde. Dichtekarten gleicher Qualität können verwendet werden, um zuverlässige Atommodelle durch de novo Backbone-Tracing sowie reziproke oder Real-Space-Verfeinerung zu konstruieren und so einen soliden strukturellen Rahmen für das Verständnis komplexer molekularer Mechanismen zu schaffen.
ACCESION CODES:
Die Koordinaten für die EM-Struktur und die unverarbeiteten Filme wurden in der Elektronenmikroskopie-Datenbank und dem Elektronenmikroskopie-Pilot-Bildarchiv unter den Zugangsnummern EMD-3645 bzw. EMPIAR-10089 hinterlegt.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken D. Roderer für die Bereitstellung von TcdA1 Mikrophotographien. Wir danken Steve Ludtke für seine laufende Unterstützung der EMAN2 Infrastruktur. Diese Arbeit wurde durch Mittel der Max-Planck-Gesellschaft (nach SR) und des Europäischen Rates im Rahmen des Siebten Rahmenprogramms der Europäischen Union (RP7 / 2007-2013) (Zuschuss Nr. 615984) (nach SR) und von den nationalen Instituten von Gesundheit R01 GM60635 zu PAP).
Materials
| SPHIRE | Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund and Houston Medical School, Houston, Texas | http://sphire.mpg.de | |
| UCSF Chimera | University of California, San Francisco | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
| Unblur | Janelia Farm Research Campus, Ashburn | http://grigoriefflab.janelia.org/unblur | |
| Coot | MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge | http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | |
| EMAN2 | Baylor College of Medicine, Houston | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 | |
| Computing Cluster with 1824 cores | Max Planck Institute of Molecular Physiology | Linux Cluster with 76 nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM | |
| TITAN KRIOS electron microscope | FEI | 300 kV, Cs correction, XFEG | |
| Falcon II direct electron detector | FEI | ||
| EPU (automated data acquisition software) | FEI | https://www.fei.com/software/epu/ |
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