Isolamento, caratterizzazione e purificazione dei macrofagi dai tessuti colpiti da infiammazione obesità

Modelli murini sono stati ampiamente utilizzati per studiare la dinamica delle malattie umane. Adeguato isolamento delle cellule residenti del tessuto da topi in uno stato malato può fornire una piattaforma per comprendere i contributi molecolari e cellulari alla patogenesi di una malattia¹. Un disordine che è di fondamentale importanza è l’obesità. L’incidenza dell’obesità continua ad aumentare in tutto il mondo in parallelo con l’insulino-resistenza e di tipo 2 mellitus del diabete, malattia cardiovascolare e steatosi epatica^2,3. Eccessivo consumo di nutrienti è ulteriormente inclinato da riduzione dell’attività fisica innescando segnali alterati provenienti dal tessuto adiposo, che può alterare l’ambiente cellulare degli altri tessuti periferici quali l’aorta e fegato⁴. Tale perturbazione dell’omeostasi metabolica si traduce in un di infiammazione sistemica cronica di basso grado⁵.

Classica attivazione dei macrofagi residenti per l’aorta e fegato, nonché il loro reclutamento al tessuto adiposo bianco (WAT) ha dimostrato di non solo avviare il dysregulation di segnali metabolici, ma anche sostenere l’infiammazione^6,7. L’eterogeneità fenotipica e funzionale dei macrofagi è fortemente associato con la patogenesi dell’obesità correlate a co-morbidità⁷. La plasticità dinamica nella polarizzazione del macrofago consente queste cellule ad esporre una gamma di fenotipi attivati che coordinano la progressione e la risoluzione di infiammazione⁸. Mentre i macrofagi (M1) classicamente attivati sono implicati nella propagazione dell’infiammazione, i macrofagi (M2) in alternativa attivati sono stati associati con risoluzione e tessuto riparazione^9,10.

Come il corpo subisce stress metabolico, tessuto adiposo bianco si accumula in modo anomalo. Il tessuto adiposo espanso attira e trattiene le cellule infiammatorie che profondo alterano la normale funzione degli adipociti per promuovere l’insulino-resistenza, iperglicemia e diabete mellito di tipo 2 in ultima analisi, l’insulino-resistenza o iperglicemia^{11, 12}. In parallelo, tessuto adiposo bianco rimodella in risposta a segnali infiammatori rilasciato da infiltrato classicamente attivati (M1) tessuto adiposo macrofagi (ATMs)^13,14. Questo organo multi-cellulare esercita una cascata di segnali che deraglia la normale funzione di altri organi del corpo come l’aorta e fegato⁴.

Il fegato è un concentrato di metabolico che si adatta in risposta a stimoli provenienti da vicine dysregulated WAT¹⁵. Epatici macrofagi o cellule di Kupffer, in risposta a cambiamenti metabolici, secernono citochine infiammatorie che trasformano entrambi parenchimatica e fenotipo delle cellule non parenchimali e promuovono il rimodellamento tissutale. Accumulo di lipidi epatici, infiammazione, depositi eccessivi di matrice extracellulare, necrosi e funzione eventuale perdita segue gli insulti infiammatori contribuendo ad ampio spettro di danni al fegato associati con epatopatia steatosica non alcolica ^16,17,18.

In parallelo al compromesso WAT e funzione epatica, grandi arterie si accumulano i lipidi all’interno della parete arteriosa come il corpo subisce lo stress metabolico cronico¹⁹. Accumulazione del lipido arteriosa innesca la secrezione di chemochine dalle cellule endoteliali attivate e successiva assunzione di monociti²⁰. Una volta reclutate, monociti proliferano, differenziano, ingeriscono lipoproteine e diventano cellule della gomma piuma. Atherogenesis è avviata e sostenuta da attività pro-infiammatoria di reclutati e macrofagi lipido-carichi residente in tessuto. Soccombere ai segnali extracellulari ed intracellulari stress inoltrati in questo microambiente atherogenic, questi macrofagi quindi impegnano in una cascata di segnalazione di apoptotic. Come queste cellule schiumose muoiono, essi contribuiscono loro contenuto lipidico riempito al nucleo necrotico della lesione, che poi conduce alla rottura della placca, infarto miocardico e ictus.

Collettivamente, l’eterogeneità fenotipica del macrofago orchestra in parte l’obesità indotta da cambiamenti infiammatori osservati in tessuti dysregulated come WAT, fegato e dell’aorta^8,21. Caratterizzazione di reclutati e macrofagi residenti tessuto potrebbero fornire la comprensione nei potenziali bersagli molecolari che manipolano macrofago fenotipo¹. Per caratterizzare in modo efficace i macrofagi dai tessuti infiammati obesità-indotta, una sospensione di singola cellula può essere ottenuta tramite digestione enzimatica. Tali protocolli di dissociazione devono essere efficace nel sufficientemente degradante tessuto connettivo riducendo la morte delle cellule immuni e fornendo resa cellulare ottimale. La miscela di enzimi dipende dal tipo di tessuto e suo strutturale compongono. Tessuti resistenti, come l’aorta richiede più forte attività enzimatica, rispetto al fegato e WAT, per raggiungere la dissociazione dei tessuti. Dalla sospensione unicellulare, macrofagi residenti del tessuto possono essere inequivocabilmente caratterizzati o isolati per ulteriore analisi, a valle quali profiling trascrizionale.

Qui un protocollo di tessuto-specifico è descritto che utilizza la digestione della collagenosi-dipendente del tessuto e citometria a flusso policromatici efficacemente isolare e caratterizzare i macrofagi residenti in tessuto ottenuti da obesità dieta tradizionale ha indotto, aterosclerosi, semplice steatosi e steatoepatite modelli murini. Simultanea di colorazione degli indicatori della superficie delle cellule con anticorpi contro del leucocita-(CD45 e/o CD11b) e del macrofago – antigeni specifici (F4/80) è spesso utilizzato per identificare il macrofago popolazioni²². Fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) sono una strategia potente utilizzata per ordinare queste popolazioni identificate a elevata purezza. La popolazione ordinata quindi possa essere valutata per profili di gene specifico fenotipo mediante analisi molecolare a valle (ad esempio, reazione a catena della polimerasi quantitativa real time)²³. Sebbene la citometria a flusso standard e flusso cytometry-base cella ordinamento sono strumenti potenti nel distinguere i macrofagi all’interno di una sospensione cellulare notevolmente eterogenei, i protocolli ex devono essere ottimizzati per garantire successo uscita. In questo studio, protocolli che efficacemente isolare e caratterizzano i macrofagi specifico tessuto vitale sono descritti; ancora più importante, questo studio fornisce approfondimenti cruciali di questioni tecniche che spesso sorgono, così come le strategie proattive e Trouble-Shooting per prevenire e/o risolverli.