Прямолинейный метод глюкозинолатов экстракции и анализа с высоким давлением жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
Summary
Here, we describe in great detail an established and robust protocol for the extraction of glucosinolates from ground plant materials. After an on-column sulfatase treatment of the extracts, the desulfoglucosinolates are eluted and analyzed by high-pressure liquid chromatography.
Abstract
Glucosinolates are a well-studied and highly diverse class of natural plant compounds. They play important roles in plant resistance, rapeseed oil quality, food flavoring, and human health. The biological activity of glucosinolates is released upon tissue damage, when they are mixed with the enzyme myrosinase. This results in the formation of pungent and toxic breakdown products, such as isothiocyanates and nitriles. Currently, more than 130 structurally different glucosinolates have been identified. The chemical structure of the glucosinolate is an important determinant of the product that is formed, which in turn determines its biological activity. The latter may range from detrimental (e.g., progoitrin) to beneficial (e.g., glucoraphanin). Each glucosinolate-containing plant species has its own specific glucosinolate profile. For this reason, it is important to correctly identify and reliably quantify the different glucosinolates present in brassicaceous leaf, seed, and root crops or, for ecological studies, in their wild relatives. Here, we present a well-validated, targeted, and robust method to analyze glucosinolate profiles in a wide range of plant species and plant organs. Intact glucosinolates are extracted from ground plant materials with a methanol-water mixture at high temperatures to disable myrosinase activity. Thereafter, the resulting extract is brought onto an ion-exchange column for purification. After sulfatase treatment, the desulfoglucosinolates are eluted with water and the eluate is freeze-dried. The residue is taken up in an exact volume of water, which is analyzed by high-pressure liquid chromatography (HPLC) with a photodiode array (PDA) or ultraviolet (UV) detector. Detection and quantification are achieved by conducting comparisons of the retention times and UV spectra of commercial reference standards. The concentrations are calculated based on a sinigrin reference curve and well-established response factors. The advantages and disadvantages of this straightforward method, when compared to faster and more technologically advanced methods, are discussed here.
Introduction
Подсчитано , что растения производят более 200000 различных типов химических соединений 1. Только меньшинство этих соединений, кажется, играет определенную роль в первичном метаболизме растений ", который роста и размножения видов топлива; большинство из них так называемые вторичные метаболиты. Несмотря на свое название, вторичные метаболиты часто имеют решающее значение для выживания растений и воспроизводства, поскольку они служат для привлечения опылителей или защитить растение от патогенных микроорганизмов и травоядных 1.
Глюкозинолаты представляют собой весьма разнородную класс вторичных метаболитов , которые были изучены в течение более 150 лет 2. На сегодняшний день, более 130 различных структурно глюкосинолаты были идентифицированы 3. В широком смысле, глюкосинолаты могут быть подразделены на различные классы, основанные на аминокислоты, из которых они синтезированы. Индолглюкозинолаты, например, синтезируются из аминокислотытриптофан, в то время как фенилаланин обеспечивает базовый скелет для синтеза ароматических глюкозинолатов 4. Внутри классов, существует высокий уровень структурного разнообразия, которое вызывается путем последовательных стадий удлинения цепи в биосинтетических путей, таких , как в классе алифатических глюкозинолатов, или путем модификации цепи стороне (например, гидроксилирование) 4, 5. Один глюкозинолатов видов растений может содержать до 37 различных глюкозинолатов , принадлежащих к различным структурным классам 6. Несмотря на то, виды растений имеют типичные профили глюкосинолатов, внутривидовая изменчивость для типов глюкозинолатов часто встречается среди лиц и групп населения , 6, 7. Малонарушенные глюкосинолаты хранятся в вакуолях растительных клеток и могут быть найдены в любом надземной или подземной органа 7, <вир класс = "Xref"> 8, 9. После разрыва клеток (например, herbivory), глюкозинолатов высвобождаются и смешивают с ферментом мирозиназой, положив начало масла бомбу 10 горчицу. Из – за активности мирозиназой, и в зависимости от структуры глюкозинолатов, условий реакции, а также наличие модифицирующих ферментов, образуются различные едкие, токсичных или вредных соединений, таких как нитрилы и (МОС) роданиды 11. Продукты реакции имеют высокую биологическую активность; например, они служат в качестве репеллентов от насекомых травоядных общего профиля 12. Наследственность и биосинтетических путей глюкозинолатов хорошо изучены, в основном из – за их важности для травоядных и сопротивления патогена, их значение в качестве компонентов аромата в горчицы и капусты, а также их отрицательные (progoitrin) и положительных (глюкорафанина) воздействие на здоровье человека 5, </suр> 13, 14.
Из-за большого интереса к глюкозинолатов как биологически активных соединений, способов экстракции и обнаружения на основе обращенно-фазовой жидкости под высоким давлением хроматографии (ВЭЖХ) , оснащенную ультрафиолетовой (УФ) или массив фотодиод (PDA) детекторы обычно использовались начиная с 1980 – х годов 15 , На основе этого метода, Европейских сообществ выдается стандартный протокол , который был проверены и подтверждены в нескольких лабораториях для анализа глюкозинолатов в масличных культур (Brassica париз, рапсового, канола 16). Другие добавляют к этому методу (например, путем определения дополнительных факторов отклика для глюкозинолатов, которые не присутствуют в рапс) 17. Несмотря на повышение доступности жидкостная хроматография платформ (LC-MS) и протоколов с высокой пропускной способностью для анализа 18 глюкозинолатов <suр>, 19, оригинальный метод ВЭЖХ-УФ / КПК до сих пор широко используется учеными. Основные причины, что этот метод является простым, экономически эффективным и относительно доступными для лабораторий без обширной инфраструктуры знаний химико-аналитической. Для того, чтобы служить этому сообществу, мы здесь подробно протокол для экстракции глюкозинолатов из растительных материалов и анализа их desulfo-форм с HPLC-PDA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наибольшие преимущества этого созданы и широко используемый метод является то, что она является надежной, довольно простой и относительно недорогой на образец. Большая часть оборудования, необходимого для экстракции и анализа, должны быть доступны в стандартной лабораторной или может быть построенного собственными силами, за исключением ВЭЖХ-ФДА. Еще одно преимущество состоит в том, что desulfoglucosinolates растворенные в воде химически достаточно стабилен при хранении прохладное и в герметичных (ВЭЖХ) флаконов, таким образом экстракты можно было легко транспортировать для ВЭЖХ-анализа в другом месте. В отличие от платформ LC-MS, которые требуют специальной подготовки и большой практический опыт для управления программным обеспечением и анализа данных, ВЭЖХ-УФ / КПК можно легко запускать после короткого периода обучения. Это не только снижает затраты на процедуры, но и делает этот метод более доступным для широкого круга ученых, в том числе студентов.
В общем случае, когда процедуры, описанные выше, с последующим сторожныLLY, несколько проблем должно произойти. В общем, пики глюкозинолатов очень хорошо разделены на хроматограмме. Если это не так, программа градиент может быть адаптирован путем уменьшения скорости увеличения ацетонитрила в качестве элюента. В качестве альтернативы, строительство в новой предварительной колонке (200-500 инъекции) или колонке (1500 -2000 инъекции) может решить эту проблему. Время от времени, хроматограммы единичных образцов в партии может показать очень мало или совсем нет пиков. Это, как правило , из – за ошибок при использовании пипеток при добавлении сульфатазы (например, колонна была пропущена или сульфатазы не был должным образом смывается в колонку). В качестве альтернативы, концентрация глюкосинолатов в экспериментальных материалов, возможно, были ниже, чем ожидалось, и слишком мало материала был использован для экстракции. Если последнее имеет место, объем впрыска может быть увеличена до 100 мкл, или точный аликвоты (например, 800 мкл) экстракта может быть сконцентрирован. Последнее может быть достигнуто путем сублимационной сухойИнг экстракта, растворением остатка в меньшем объеме (например, 100 мкл) , воды, и реинжекции с использованием той же эталонной кривой. В расчетах для исходной концентрации экстракта, число следует умножить на коэффициент разбавления. Если это не решает проблему, материалы должны быть извлечены еще раз, используя больше исходного материала. Если это больше, чем 100 мг, объем растворителей экстракции и размеры труб должны быть скорректированы пропорционально для поддержания эффективности экстракции.
Дополнительным преимуществом является то, что этот метод был хорошо проверен. Это потому , что он был описан в качестве стандартного метода для количественного определения глюкозинолатов в рапсовое, для которых процедуры и точность были подтверждены в нескольких лабораториях 16. Кроме того, генетический фон, биосинтез и биологические функции глюкозинолатов подвержены интенсивных усилий исследований, в модеэль видов растений Резуховидка Таля среди других 4, 6, 12. Таким образом, многие факторы отклика для точного количественного определения desulfoglucosinolates по отношению к синигрин хорошо определены и общедоступны 15,17. Даже если протоколы LS-MS на основе более высокой пропускной способностью , более чувствительны и способны (предварительно) определить глюкозинолатов , для которых нет стандартов отсутствуют 18, 19, 20, отсутствие универсальных факторов отклика для LC-MS ограничивает точное количественное определение концентрации глюкозинолатов 18. Кроме того, эти методы, как правило, не включают в себя стадию сушки вымораживанием и количество воды в свежем растительном материале является неучтенных в расчетах, что делает трудным точное определение объемов. И, наконец, потому, что наш метод экстракции включает столбец на основеочистка и стадия концентрирования, она также может быть применена к «грязных» образцов с низкой концентрацией глюкозинолатов, таких как почвы 21.
По сравнению с ЖХ-МС на основе методов , которые обычно извлекают свежезамороженной материалов, используемых 96-луночные планшеты для экстракции, и не включают стадию сульфатазы 18, 19, наш метод относительно больших затрат времени и труда , интенсивно. С помощью стоек колонн, описанных в данной статье, один человек может добывать около 100-150 проб в течение одного дня. Элюирование (на следующий день), заморозить сушки (в течение ночи), и повторное растворение может иметь место в течение следующих двух дней. С помощью автоматизированной ВЭЖХ инжектора, запуск и уравновешивающим время 40-45 мин на инъекцию, и без каких-либо непредвиденных событий, то потребуется 3-4 дней, чтобы получить данные для этого набора образцов. Когда программное обеспечение ВЭЖХ позволяет производить автоматическую Количественное основанный на синигрин кривой, ручной проверки на хроматограммах и реак задания на 100 выборок может принимать только еще 1 или 2 часа до того, как данные могут быть использованы для статистического анализа.
Несмотря на повышение доступности стандартов глюкозинолатов, лишь малая часть из более чем 130 кандидатов в настоящее время может быть коммерчески куплены. Тем не менее, с несколькими ссылками для каждого из биосинтетических классов; доступ к базам данных литературы с указанием соединений найденных ранее в видов растений (например, Фэхи и др . 22); базовые знания хроматографических принципов, таких как логика элюотропную ряда (например, для увеличения количества Cs на боковой цепи в алифатических соединений, 3 и 4); и проверка отдельных образцов на LC-MS 19 или изолированных глюкозинолатов на ЯМР 23, можно легко преодолеть это ограничение. Большинство протоколов для глюкозинолатов анализа используют внутренние эталонных кривых(То есть, определенная концентрация для извлечения синигрин или синальбин к экстракции растворителем 16, 17, 19). В принципе, внутренние опорные кривые являются более подходящими для коррекции отдельных ошибок обработки образца и, таким образом, теоретически дают более высокую точность. Несмотря на это преимущество, мы предпочитаем использовать пятибалльной внешний эталонной кривой а, как мы часто анализируем различные дикие виды, некоторые из которых содержат высокие уровни синигрин (например, горчица чёрная 24) или синальбин (например, Sinapis альба 25) два глюкозинолатов ссылки, для которых коэффициенты чувствительности доступны. Кроме того, добавление внутренних стандартов к каждому образцу увеличивает стоимость анализов, а высококачественные опорные глюкосинолатов стандарты, как правило, довольно дорого.
В заключение, несмотря на затратных по времени шагов, этот протоколобеспечивает простой и доступный метод для извлечения и количественного определения глюкозинолатов в образцах растений. Тем не менее, важно учитывать , что сами уровни глюкозинолатов являются только индикацию потенциальной биологической активности, который рассматривается как необходимость вступать в реакцию с мирозиназой способности и изменения в продуктах реакции могут возникать из одного глюкозинолатов 11. Validation анализы должны быть выполнены, чтобы подтвердить биологическую значимость.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NMvD thanks Dr. Michael Reichelt (Max-Planck-Institute for chemical Ecology, Jena, Germany) for providing the first reference samples when she started using this method 16 years ago. Ciska Raaijmakers (NIOO-KNAW, Wageningen, the Netherlands), Sebastian Krosse (B-Ware, Nijmegen, the Netherlands), and Christian Ristok (iDiv, Leipzig) are acknowledged for improving the protocol over the course of the years. Mirka Macel and Martine Huberty (University Tübingen, Germany) are acknowledged for their permission to use the Rorippa chromatogram. The authors gratefully acknowledge the support of the German Centre for Integrative Biodiversity Research (iDiv) Halle-Jena-Leipzig, funded by the German Research Foundation (FZT 118).
Materials
| Methanol HiPerSolv CHROMANORM® gradient grade for HPLC grade | VWR | 20,864,320 | |
| Sodium acetate (NaOAc) | Sigma-Aldrich | W302406-1KG-K | |
| HCL | VWR | 1,090,571,000 | |
| Sephadex | Sigma-Aldrich | A25120-10G | |
| (−)-Sinigrin hydrate from horseradish |
Sigma-Aldrich | S1647-500MG | |
| Aryl Sulfatase | Sigma-Aldrich | S9626-10KU | |
| Ethanol | VWR | 20,816,298 | |
| Pasteur Pipette | Carl Roth | 4518.1 | |
| Glass Wool | Carl Roth | 7377.1 | |
| Glass /wooden stick | VWR | HERE1080766 | |
| 2 mL reaction tubes | VWR | 211-2606 | |
| Dissecting needle | Carl Roth | KX93.1 | |
| Rotilabo-lab dishes | Carl Roth | 0772.1 | Waste tray |
| Freeze Dryer Freezone 12 L | Labconco | 7960030 | |
| Acetonitril super gradient grade | VWR | 83,639,320 | |
| Water bath | VWR | 462-5112 | |
| Ultrasonic bath | Fisher Scientific | FB 15061 | |
| PH Electrode | Thermo Fisher Scientific | STARA2115 | |
| Centrifuge Heraeus Multifuge X1 | Thermo Fisher Scientific | 75004210 | |
| Pre-Column | Thermo Fisher Scientific | 69697 | C18 column (4.6 x 10 mm, 5 µm, 300 Å) |
| Column Acclaim 300 | Thermo Fisher Scientific | 60266 | C18 column (4.6 x 150 mm, 3 µm, 300 Å) |
| HPLC Ultimate 3000 | Thermo Fisher Scientific | with column oven and UV or PDA detector | |
| Flask 1000 mL | VWR | 215-1595 | |
| Glucosinolate reference compounds | Phytoplan | various | http://www.phytoplan.de/ |
References
- Hartmann, T. From waste products to ecochemicals: Fifty years research of plant secondary metabolism. Phytochemistry. 68 (22-24), 2831-2846 (2007).
- Will, H., Laubenheimer, A. Ueber das Glucosid des weissen Senfsamens. Justus Liebigs Annalen der Chemie. 199 (1), 150-164 (1879).
- Agerbirk, N., Olsen, C. E. Glucosinolate structures in evolution. Phytochemistry. 77, 16-45 (2012).
- Halkier, B. A., Gershenzon, J. Biology and biochemistry of glucosinolates. Ann Rev Plant Biol. 57, 303-333 (2006).
- Sønderby, I. E., Geu-Flores, F., Halkier, B. A. Biosynthesis of glucosinolates – gene discovery and beyond. TIPS. 15 (5), 283-290 (2010).
- Kliebenstein, D. J., et al. Genetic control of natural variation in Arabidopsis glucosinolate accumulation. Plant Physiol. 126 (2), 811-825 (2001).
- van Leur, H., Raaijmakers, C. E., van Dam, N. M. A heritable glucosinolate polymorphism within natural populations of Barbarea vulgaris. Phytochemistry. 67 (12), 1214-1223 (2006).
- Kelly, P. J., Bones, A., Rossiter, J. T. Sub-cellular immunolocalization of the glucosinolate sinigrin in seedlings of Brassica juncea. Planta. 206 (3), 370-377 (1998).
- van Dam, N. M., Tytgat, T. O. G., Kirkegaard, J. A. Root and shoot glucosinolates: a comparison of their diversity, function and interactions in natural and managed ecosystems. Phytochem Rev. 8 (1), 171-186 (2009).
- Ratzka, A., Vogel, H., Kliebenstein, D. J., Mitchell-Olds, T., Kroymann, J. Disarming the mustard oil bomb. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (17), 11223-11228 (2002).
- Wittstock, U., Kliebenstein, D. J., Lambrix, V., Reichelt, M., Gershenson, J., Romeo, J. T. . Integrative Phytochemistry: From ethnobotany to molecular ecology: Recent Advances in Phytochemistry. 37, (2003).
- Hopkins, R. J., van Dam, N. M., van Loon, J. J. A. Role of glucosinolates in insect-plant relationships and multitrophic interactions. Ann Rev Entomol. 54 (1), 57 (2009).
- Kliebenstein, D. J., Gershenzon, J., Mitchell-Olds, T. Comparative quantitative trait loci mapping of aliphatic, indolic and benzylic glucosinolate production in Arabidopsis thaliana leaves and seeds. 遗传学. 159 (1), 359-370 (2001).
- Mithen, R., Bennett, R., Marquez, J. Glucosinolate biochemical diversity and innovation in the Brassicales. Phytochemistry. 71 (17-18), 2074-2086 (2010).
- Buchner, R., Wathelet, J. P. . Glucosinolates in rapeseed. , 50-58 (1987).
- . Oil seeds – determination of glucosinolates High Perfomance Liquid Chromatography. Official Journal of the European Communities. , 27-34 (1990).
- Brown, P. D., Tokuhisa, J. G., Reichelt, M., Gershenzon, J. Variation of glucosinolate accumulation among different organs and developmental stages of Arabidopsis thaliana. Phytochemistry. 62 (3), 471-481 (2003).
- Glauser, G., Schweizer, F., Turlings, T. C. J., Reymond, P. Rapid Profiling of Intact Glucosinolates in Arabidopsis Leaves by UHPLC-QTOFMS Using a Charged Surface Hybrid Column. Phytochem Analysis. 23 (5), 520-528 (2012).
- Crocoll, C., Halkier, B. A., Burow, M. . Current Protocols in Plant Biology. , (2016).
- Griffiths, D. W., Bain, H., Deighton, N., Botting, N. P., Robertson, A. A. B. Evaluation of liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionisation-mass spectrometry for the identification and quantification of desulphoglucosinolates. Phytochem Analysis. 11 (4), 216-225 (2000).
- Gimsing, A. L., Kirkegaard, J. A. Glucosinolates and biofumigation: fate of glucosinolates and their hydrolysis products in soil. Phytochem Rev. 8 (1), 299-310 (2009).
- Fahey, J. W., Zalcmann, A. T., Talalay, P. The chemical diversity and distribution of glucosinolates and isothiocyanates among plants. Phytochemistry. 56, 5-51 (2001).
- de Graaf, R. M., et al. Isolation and identification of 4-α-rhamnosyloxy benzyl glucosinolate in Noccaea caerulescens showing intraspecific variation. Phytochemistry. 110, 166-171 (2015).
- van Dam, N. M., Raaijmakers, C. E. Local and systemic induced responses to cabbage root fly larvae (Delia radicum) in Brassica nigra and B. oleracea. Chemoecology. 16 (1), 17-24 (2006).
- Gols, R., et al. Temporal changes affect plant chemistry and tritrophic interactions. Bas Appl Ecol. 8 (5), 421-433 (2007).
