تحديد حاتمة الخطي B-خلية المعترف بها الأجسام المضادة وحيدة النسيلة-الببتيد الضوئي بمساعدة
Summary
Here, the authors present a simple and efficient protocol to define a linear antigenic epitope using a purified monoclonal antibody and peptide scanning through dot-blot hybridization. The identified epitope can then be used in therapeutic and diagnostic applications.
Abstract
تحديد حاتمة مولدة من قبل النظام المناعي يسمح لفهم آلية الحماية من الأجسام المضادة التي قد تسهل تطوير اللقاحات والعقاقير الببتيد. الببتيد المسح هي طريقة بسيطة وفعالة تعين مباشر حاتمة الخطية المعترف بها من قبل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (ماب). هنا، والكتاب تقدم منهجية تقرير حاتمة التي تنطوي على البروتينات اقتطاع متسلسل المؤتلف، تصميم الببتيد الاصطناعية، وتهجين نقطة وصمة عار للاعتراف الأنتيجين من فيروس العصبي نخر بروتين معطف باستخدام ماب تحييد. وتعتمد هذه التقنية على تهجين نقطة وصمة عار من الببتيدات الاصطناعية وMABS على (PVDF) غشاء فلوريد البولي. يمكن تضييق المنطقة مولدة الحد الأدنى من البروتين الفيروسي معطف معترف بها من قبل RG-M56 ماب أسفل خطوة بخطوة قلص رسم الخرائط الببتيد على 6 مير الببتيد حاتمة. وبالإضافة إلى ذلك، مسح ألانين الطفرات وبقايا الفرعيةstitution لا يمكن أن يؤديها لتوصيف أهمية ربط كل بقايا الأحماض الأمينية التي تشكل حاتمة. تم العثور على بقايا المرافقة الموقع حاتمة للعب أدوارا حاسمة في تنظيم الببتيد التشكل. ويمكن استخدام الببتيد حاتمة التي تم تحديدها لتشكيل بلورات من المجمعات الببتيد الأجسام المضادة حاتمة لدراسة حيود الأشعة السينية والمنافسة وظيفية، أو العلاجات.
Introduction
في الجهاز المناعي، وإعادة التركيب من شرائح V و D و J يسمح لأجسام مضادة لخلق اختلافات هائلة من المناطق التكامل تحديد (تقارير الإنجاز الموحدة) للربط إلى مختلف المستضدات لحماية المضيف من العدوى المسببة للأمراض. الدفاع تحييد الأجسام المضادة ضد المستضدات يعتمد على التكامل المكاني بين تقارير الإنجاز الموحدة من الأجسام المضادة والحواتم من المستضدات. ولذلك، فإن فهم هذا التفاعل الجزيئي مساعدة تصميم لقاح وقائي والتنمية الببتيد المخدرات العلاجية. ومع ذلك، قد تتأثر هذا التفاعل تحييد كل من المجالات مولدة متعددة من مستضد واحد واحد وتقارير الإنجاز الموحدة متعددة من الأجسام المضادة، والتي بالتالي جعل عملية تحديد حاتمة أكثر تعقيدا. لحسن الحظ، وتطوير تكنولوجيا هجين، التي تدمج الخلايا المنتجة للأجسام المضادة الفردية مع خلايا المايلوما، يسمح لدفعة تقسيم باستمرار من الخلايا ثانية الأجسام المضادة المحددة شبكة شعيرية واحد، والمعروفة باسم الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (ماب) 1. خلايا هجين تنتج هذه النقية، MABS عالية تقارب ربط إلى مجال الأنتيجين واحد لمستضد معين. مع العلاقة بين مستضد الضد المعمول بها، العديد من الطرق، بما في ذلك المسح الببتيد، ويمكن استخدامها لتحديد حاتمة من مستضد باستخدام ماب المقابلة. جعلت التطورات الحديثة في تكنولوجيا الببتيد الاصطناعية تقنية الببتيد المسح الضوئي أكثر سهولة وأكثر ملاءمة لأداء. لفترة وجيزة، ويتم إنتاج مجموعة من تداخل الببتيدات الاصطناعية وفقا لتسلسل المستضد الهدف وترتبط إلى الغشاء الصلبة المعتمدة لماب التهجين. الببتيد المسح يوفر ليس فقط وسيلة بسيطة لتعيين الأجسام المضادة المنطقة ملزم، ولكن أيضا يسهل الأحماض الأمينية (أأ) الطفرات من خلال مسح بقايا أو استبدال لتقييم تفاعل ملزم بين كل بقايا أأ من الببتيد حاتمة وتقارير الإنجاز الموحدة من الأجسام المضادة.
<p cمعشوقة = "jove_content"> هنا، توضح الدراسة بروتوكول لتحديد كفاءة حاتمة خطية من البروتين معطف الهامور الأصفر فيروس نخر العصبي (YGNNV) باستخدام ماب تحييد 2، 3، 4. ويتضمن البروتوكول ماب إعداد والبناء والتعبير عن البروتينات المؤتلف اقتطاع متسلسل، الاصطناعية تصميم الببتيد متداخلة، تهجين نقطة وصمة عار، مسح ألانين، والطفرات تبديل. ونظرا لارتفاع تكلفة تركيب الببتيد، تم تعديل خطوة من اقتطاع متسلسل البروتينات المؤتلف من البروتين الهدف المنشود، وضاقت المنطقة المستضدات إلى حوالي 100-200 بقايا أأ قبل إجراء الببتيد مجموعة تحليل نقطة وصمة عار الاصطناعية.Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر هذا البروتوكول تقنية سريعة ومباشرة لتحديد حاتمة الخطية المعترف بها ماب. مع الأخذ بعين الاعتبار تكلفة تركيب الببتيد وكفاءة الإنتاج من الببتيدات وتوليفها، تم تخفيض المنطقة مولدة للبروتين معطف الفيروس عن طريق التعبير عن البروتينات المؤتلف اقتطاع متسلسل قبل تحلي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Miss Ching-Chun Lin and Miss Diana Lin of the Core Facility of the Institute of Cellular and Organismic Biology (ICOB) of Academia Sinica for offering their expertise on peptide synthesis and DNA sequencing, respectively. This study was supported by Academia Sinica.
Materials
| Hybrid-SFM medium | Gibco | 12045-076 | |
| Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS) | Gibco | 21600-069 | |
| Pfu DNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0502 | Including buffers |
| T4 DNA Ligase | Roche | 10799009001 | Including buffers |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | Including buffers |
| XhoI | New England Biolabs | R0146S | Including buffers |
| pET-20b(+) vector | Novagen, Merck Millipore | 69739 | |
| E.coli DH-5α competent cell | RBC Bioscience | RH617 | |
| E.coli BL-21(DE3) competent cell | RBC Bioscience | RH217 | |
| Ampicillin | Amresco | 0339-25G | |
| LB broth | Invitrongen | 12780-052 | |
| Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG) | MDBio, Inc. | 101-367-93-1 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| Polyoxyethylene 20 Sorbitan Monolaurate (Tween-20) | J.T.Baker | X251-07 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Glycine | Amresco | 0167-5KG | |
| Tris | Affymetrix, USB | 75825 | |
| NaCl | Amresco | 0241-1KG | |
| EDTA | Amresco | 0105-1KG | |
| Glycerol | Amresco | 0854-1L | |
| NaN3 | Sigma | S2002-500G | |
| BCIP/NBT | PerkinElmer | NEL937001PK | |
| Goat Anti-Mouse IgG, Fc fragment antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-055-008 | |
| Immobilon-P (Polyvinylidene fluoride, PVDF) | Merck Millipore | IPVH00010 | |
| Protein G Agarose Fast Flow | Merck Millipore | 16-266 | |
| QIAquick PCR Purification kit | Qiagen | 28106 | |
| UVP BioSpectrum 600 Image System | UVP | n/a | |
| VisionWorks LS Analysis Software Ver 6.8 | UVP | n/a | |
| MyCycler thermal cycler | BioRad | 1709713 |
References
- Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68 (50), 3453 (1977).
- Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).
- Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection. PLoS One. 10 (5), 0126121 (2015).
- Lai, Y. -. S., et al. Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue. J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).
- Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus. Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).
- Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnol. 11, 24 (2011).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields. PLoS One. 11 (8), e0160509 (2016).
- Metzker, M. L. Emerging technologies in DNA sequencing. Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).
- Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody. Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).
- Atassi, M. Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).
- Opuni, K. F., et al. Mass spectrometric epitope mapping. Mass Spectrom Rev. , (2016).
- Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A., Liao, I. C., Leaño, E. M. . The Aquaculture of Groupers. , 207-224 (2008).
- Conti-Tronconi, B. M., et al. Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite. 生物化学. 30 (10), 2575-2584 (1991).
- Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes. Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).
- Chen, N. C., et al. Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection. PLoS Pathog. 11 (10), e1005203 (2015).
- Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity. Biochim Biophys Acta. , (2014).
- Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides. AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).
