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医学

Usando In Vitro células vivas imágenes para explorar quimioterápicos entregado por nanopartículas basadas en lípidos

Published: November 01, 2017
doi:
10.3791/55405
,
1Laboratory Experimental Surgical Oncology, Section Surgical Oncology, Department of Surgery,Erasmus MC

Summary

Proyección de imagen de células vivas es una poderosa herramienta para visualizar procesos dinámicos. El examen de las células fijas proporciona sólo imágenes estáticas, que pueden conducir a malas interpretaciones y confusión sobre el proceso. Este trabajo presenta un método para estudiar la absorción, liberación de fármaco y localización intracelular de la nanopartículas en las células vivas.

Abstract

Técnicas de imagen convencionales pueden proporcionar información detallada sobre los procesos celulares. Sin embargo, esta información se basa en imágenes estáticas en un sistema dinámico de lo contrario, y sucesivas fases son fácilmente pasados por alto o mal interpretadas. Imágenes de células vivas y microscopía de Time-lapse, en la que las células vivas pueden seguir para horas o incluso días de una manera más o menos continua, por lo tanto son muy informativos. El protocolo aquí descrito permite la investigación de la suerte de nanopartículas quimioterapéuticas después de la entrega de doxorrubicina (dox) en células vivas. DOX es un agente intercalante que debe liberarse su nanocarrier a ser biológicamente activos. A pesar de su registro clínico durante más de dos décadas, su absorción, descomposición y liberación del fármaco no se entienden. Este artículo explora la hipótesis de que las nanopartículas basadas en lípidos son tomadas por las células del tumor y se degradan lentamente. Dox liberado entonces se transloca al núcleo. Para evitar artefactos de fijación, proyección de imagen de células vivas y microscopía de Time-lapse, que se describe en este procedimiento experimental, se pueden aplicar.

Introduction

La capacidad de seguir un proceso biológico, como las interacciones célula-célula, inter- y transporte intracelular, absorción compuesta citotóxica e interacción de la proteína-proteína de moléculas individuales en células vivas y tejidos, ha cobrado gran interés en los últimos década, ya que proporciona la dimensión adicional de “tiempo real”. En este manuscrito, se describe un método para seguir el destino intracelular de dox libre y dox incorporado en nanopartículas (Dox-NP).

Nanopartículas se han utilizado durante décadas para tratar ciertos tipos de cáncer. DOX-NP ha sido aprobado para el tratamiento de sarcoma de Kaposi relacionado con SIDA avanzado de ovario y cáncer de pecho y mieloma múltiple1. Fue una de las primeras nanopartículas liposómicos desarrolló e introdujo en el ajuste clínico. La forma libre, dox, enormemente se elimina de la circulación de la sangre, limitar su capacidad para llegar al sitio del tumor en cantidades suficientes. Además, el tratamiento es acompañado por efectos secundarios graves y limitación de dosis, como la estomatitis y la insuficiencia cardíaca. Cuando encapsulado en nanopartículas liposomal pegilada el tiempo de circulación aumenta desde minutos a días2. Este tipo de colesterol que contiene liposomas es bastante estable y esta estabilidad determina la farmacocinética del fármaco encapsulado.

Sin embargo, esta rigidez tiene un inconveniente. La capacidad citotóxica de un compuesto hacia las células tumorales es primero evaluado en vitro, y se ha demostrado que dox es más potente que Dox-NP en citotóxicos ensayos3,4. Fue presumido que la estabilidad de la portadora previene la liberación y la absorción celular de la droga, y vale la pena investigar este fenómeno más lejos. Las propiedades intrínsecas liposómicos, construidas para durar los elementos agresivos en la corriente sanguínea y llegar al sitio del tumor intacto, dio lugar a la alteración biodisponibilidad del componente citotóxico (es decir, dox) en el sitio de destino (es decir, el tumor núcleo de la célula). Aunque Dox-NP difícilmente mejora la respuesta frente a la forma libre, es de valor clínico, como encapsulado reduce significativamente los efectos cardiotóxicos del5. En los años siguientes, otros compuestos fueron encapsulados en portadores de la nano6. También, modificar las compañías dio lugar a la liberación del fármaco activada (es decir, en el sitio del tumor) pero mantuvo estabilidad en la circulación de sangre7,8. A pesar de años de investigación y uso clínico, los sinos intratumoral de nanocarriers como Dox-NP no son todavía completamente claros. En una publicación reciente, se demostró que la nanopartícula es tomada como un todo mientras que el dox queda atrapado en los lisosomas9.

La absorción celular de un lanzamiento de nanopartículas y de la droga son procesos dinámicos que mejor pueden ser monitoreados usando proyección de imagen de células vivas. Por otra parte, histología clásica, en que las células se incuban y después de eso fijo, puede dar resultados falsos si la fijación destruye el portador liposomal e introduce artefactos. El requisito principal para la proyección de imagen de células vivas es visualización, preferiblemente por fluorescencia, del proceso deseado. Ciertos compuestos, como dox, tienen una fluorescencia roja intrínseca. Además, marcadores fluorescentes pueden ser introducidos en el portador y orgánulos celulares pueden visualizarse utilizando marcadores de células vivas. De esta manera, una matriz de parámetros, como la absorción del portador, liberación del fármaco y localización celular de la portadora y la droga, puede ser reflejada y analizada. Aquí, se describe un método que sigue el destino intercelular de dox y Dox-NP en varias células del tumor en tiempo real. Además, este método puede adaptarse fácilmente para crear las condiciones ideales para dirigida (p. ej., cargada de nanopartículas10) y desencadena liberación del fármaco (p. ej., hipertermia,7).

Protocol

1. preparación montar la cámara de proyección de imagen, que consta de dos partes. Colocar un vidrio de cubierta de 25 mm ( figura 1A -1) en la parte inferior de la cámara ( figura 1A -2) y la parte superior del tornillo en la parte inferior ( figura 1A -3). No apriete demasiado, ya que puede romper el vidrio. Autoclave de toda la cámara ( figura 1A -4). Preparar medio de cultivo celular complementando Dulbecco ' s Modified Eagle ' s medio (DMEM) sin rojo de fenol con 10% de suero de ternera fetal inactivado con calor (FCS) y 1 mM L-glutamina bajo condiciones estériles. Almacenar a 4 ° C y caliente a 37 ° C antes de su uso. Mantener las células con medio de cultivo celular en cultivo frascos usando técnicas de cultivo estándar celular. Nota: Aquí, dos líneas celulares de ratón melanoma B16BL6 11 Lewis lung carcinoma (LLC) y dos melanomas humanos, BLM y 1F6 12, se utilizó y. Hacer gelatina de 0.1% por peso y disolver la gelatina en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a 37 ° C durante la noche. Esterilizar la solución por filtración a través de un filtro de 0,22 μm y almacenar a 4 ° C. 2. Las células de la placa Retire la cámara de proyección de imagen de la bolsa de esterilización en un gabinete de flujo laminar con cuidado apriete la cámara y colocar en una placa Petri. Nota: Para evitar contaminación, mantenga la cámara de proyección de imagen en una placa Petri hasta que la cámara puede colocarse bajo el microscopio. Cubrir el cristal de la cámara de proyección de imagen con 1 mL de 0.1% gelatina estéril por 20 min a 37 ° C y 5% CO 2. Nota: Esto permitirá mejor accesorio celular. Quitar el medio de los frascos de cultivo celular (ver pasos 1.2 y 1.3), lavar una vez con PBS 1 x y separar las células utilizando tripsina 0.25%. Inactivar la tripsina mediante la adición de medio de cultivo celular, recoger las células, desactivación a 1.100 x g durante 5 minutos y resuspender el precipitado en 5 mL de medio de cultivo celular. Diluir 20 μl de la suspensión celular con 20 μl de azul de tripán (que va ser tomada por las células muertas). Contar el número de células vivas y muertas usando un hemocitómetro; el número de células muertas no debe exceder del 10%. Aspirar la gelatina y las células en una disolución que permite un máximo de 70% de cobertura dentro de las 24 h de la placa. Por ejemplo, utilizar una dilución de 5 x 10 4 o 10 x 10 4 células en 1 mL. Permitir que las células se adhieran en el 5% CO 2 y 37 ° C durante 24 h. 3. Time-lapse microscopia ( figura 2) Nota: aquí, se utilizó un microscopio confocal con el titular de una etapa a la medida, aunque la mayoría de fabricantes ofrecen una gama de incubadoras para células vivas imágenes que son también es adecuado para investigar la administración de fármacos nanoparticulados. Evaluar las células bajo un microscopio para la confluencia, la morfología celular y la contaminación. Vuelva a colocar la cámara en la incubadora de CO 2. Nota: La confluencia no debe exceder el 70%. Si la morfología celular es inconsistente (es decir, las células no se adhieren) o se detecta contaminación, deseche la cámara imagen. Encender el microscopio confocal ( Figura 1E -1), luz fluorescente ( Figura 1E -2) y computadoras ( Figura 1E -3). Conectar el calentador de lente al objetivo y ponerlo a 35 ° C ( Figura 1E -4 + insert). Preparar la unidad de incubación, como se muestra en la figura 1B. Nota: Esta unidad consiste en una platina calefactada ( figura 1B -1), una etapa de flujo con un conector para el CO 2 tubos ( figura 1B -2) y sonda de CO 2 ( figura 1B -3) y un parche de cierre rojo ( figura 1B -4). Este parche se utiliza para cerrar temporalmente la unidad hasta que se coloca la cámara imagen. Coloque la unidad de incubación sobre la platina del microscopio y conectar el en – y hacia fuera – flujo CO 2 tubos ( Figura 1E -5). Abra la válvula principal de CO 2 ( Figura 1E -6) y encienda el controlador de 2 CO ( Figura 1E -7). Compruebe que el controlador se establece en 5% CO 2. Nota: Para la humedad, CO 2 pasa a través de un humidificador ( Figura 1E -8). Para los experimentos de la hipoxia, un regulador de 2 O separado ( Figura 1E -9) está incluido en la configuración de. Ajustar la temperatura de la etapa a 37 ° C ( Figura 1E -10). Para los experimentos de hipertermia, ajuste la temperatura a 42 ° C. permitir la unidad de incubación para alcanzar la temperatura seleccionada y CO un porcentaje de 2. Tomar la sala de proyección de imagen del principal CO 2 incubadora y transporte de la cámara en una placa Petri a la sala de microscopía. La sala de proyección de imagen ( figura 1A -4) en una a medida, 35 mm de diámetro etapa titular ( figura 1A -5) y cerrar el compartimiento con tapa cierre a medida ( Figura 1A -6). Nota: La tapa permite CO 2 pasar y evita la evaporación y contaminación. Abra la unidad de incubación, reemplazar el parche rojo con la imagen de la cámara y cerrar la unidad ( figura 1). Para ello lo más rápido posible para evitar el enfriamiento de las células. Asegúrese de que ningún cable se pegan entre la etapa y el microscopio. Deja la unidad para aclimatarse durante 30 minutos El software abierto y enciende los lasers. Nota: Aquí, argón nm 488 543 nm helio-neon, láseres de helio-neón 633 nm se utilizó y. Hacer una nueva base de datos haciendo clic en " nueva " en la ficha de archivo nombre y guardar la base de datos. Establecer la configuración haciendo clic en " Config " debajo de la ficha de adquisición seleccione " modo de canales " y " sola pista " para evaluar un solo fluoróforo o " Multi pista " para varios fluoróforos. Seleccione los filtros de paso de banda apropiado que empareja el fluoróforo (p. ej., 560 a 615 nm filtro para dox y Dox-NP; vea los resultados de representante para más ejemplos). Seleccione el canal de campo brillante en uno de los temas. Establecer el control de exploración haciendo clic en " Análisis " debajo de la ficha adquirir conjunto el tamaño de fotograma (1.024 x 1.024), velocidad de escaneo (óptima), escanear dirección (8-bit, solo) y media (4) la exploración haciendo clic en " modo " fijar el agujero de alfiler (200 μm), ganancia y offset ( por ejemplo, 580 700 y 835; Ver figura 3) y energía del laser (488 = 10%, 543 = 100%, 633 = 100%) haciendo clic en " canales. " guardar esta configuración haciendo clic en " Config " en el configuración ficha y guardar en la base de datos de configuración. Establecer el lapso de tiempo haciendo clic en " Multi tiempo X " ( figura 1) en la ficha de Macro haga clic en " solo ubicación ". Para mantener las células en el foco, seleccionar el enfoque automático en la macro haciendo clic en " Auto foco. " Nota: enfoque automático se consigue con el láser de 633 nm usando el reflejo del vidrio como un punto de referencia. Aplicar la configuración guardada pulsando " pista solo " o " Multi pista, " de desplazamiento a la configuración requerida en la base de datos de configuración, ajuste el intervalo de tiempo (por ejemplo, 15 min), número de análisis (p. ej., 97) y Haga clic en " carga Config. " Nota: Use estos ajustes, se realizará una serie de tiempo de 97 x 15 min = 24 h. Nombre del time-lapse en el " Base de nombre de archivo " y seleccione la base de datos (hecha en el paso 3.11) haciendo clic en " Base de datos de imagen " para salvar el lapso de tiempo. Establecer una carpeta temporal haciendo clic en " carpeta Tmp imagen. " Nota: Si el sistema se detiene o se bloquea por cualquier motivo, las imágenes se encuentran en esta carpeta. Abra la unidad de incubación, levante el anillo de la proyección de imagen, añada una gota de aceite de inmersión el objetivo y cerrar la unidad tan rápido como sea posible. Enfoque y seleccione una posición en la cámara de proyección de imagen. Nota: Esta posición contiene células en una monocapa, con un mínimo de 70% de confluencia, lo que permite la proyección de imagen de células individuales. Verificar los ajustes de configuración para el fondo y corregir si es necesario. Nota: El fondo puede ser corregido reduciendo el poder de ganancia o láser. Cualquier cambio en la configuración hay que salvar (ver paso 3.17) y cargado (ver paso 3.18) nuevamente en la macro de. En el gabinete de flujo laminar, diluir drogas gratis o nanopartículas en una concentración de 5 μg/mL droga o el 0,05 μmol de lípidos en el medio de cultivo celular. Filtrar con un filtro de jeringa 0,22 μm si las drogas/nanopartículas no son estériles. Abrir la cámara de incubación, levante la tapa de sellado, retire el medio de las células, agregar 1 mL de medicamento diluidas/nanopartículas y cierre la unidad tan rápido como sea posible. Centrarse en las células y el lapso de tiempo de inicio haciendo clic en " hora de inicio " en la macro Multi tiempo X. Compruebe regularmente si las células siguen en foco o utilizan el enfoque automático (ver paso 3.16). El programa guarda automáticamente el Time-lapse en la base de datos; no cierre la base de datos mientras se ejecuta el programa. 4. Análisis de datos dependiendo de la pregunta original de investigación, utilizar programas de software como el ImageJ para análisis de datos (véase la sección resultados para ejemplos).

Representative Results

Etiquetado portadores liposomal con diferentes marcadores ha sido descrito previamente9. Portadores con dioctadecyl far-red tetramethylindotricarbocyanine perclorato (lo hizo; Ex = 644 nm; Em = 665 nm) o 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) verde (CF-PE; Ex = 490 nm; Em = 515 nm) se presenta en este manuscrito. Para mostrar intercelulares similitudes y diferencias en la absorción, liberación y localización intracelular, se estudiaron varios tipos de tumor. Estos incluyen dos líneas de ratón, el melanoma B16BL6 del11 y el carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) y dos melanomas humanos, un altamente metastático (BLM) y una de12,de melanoma no metastásico (1F6)13. Todos los experimentos se realizaron utilizando células vivas. En todos los experimentos, una concentración de 5 μg/mL dox, 5 μg/mL Dox-NP o 0,05 μmol de nanopartículas fueron administrados para 3 o 24 h. medidos y analizado dox (en forma libre, liberado, encapsulado, secuestrado o intercalado) se denominan DXR. 40 X (apertura numérica: 1.3) objetivo de aceite fue utilizado, y la proyección de imagen fue realizada con un láser de argón 488 de nm (energía de 10% / 0,2 mW) y un filtro de paso banda 505 a 550 nm para CF-PE y marcador lisosomal (LM)-verde. A 543 nm láser de helio-neon (100% / potencia de 0,2 mW) y un filtro de paso banda de 560 a 615 nm para dox, Dox-NP y rojo marcador lisosomal. A 633 nm láser de helio-neon (potencia 100% / 0.5 mW) y un filtro de paso de largo 640 nm se utilizó para lo. Debido a su encapsulado, la citotoxicidad en vitro , biodisponibilidad y farmacocinética de dox fueron significativamente alterados3,9,14. La diferencia entre la biodisponibilidad de la droga cuando se administra en forma libre y encapsulado se demuestra en la figura 3. DOX es un agente intercalante y debe entrar al núcleo celular para ser citotóxico. Figura 3 y relacionados peliculas 1 y 2 muestran un 3 h Time-lapse de BLM células tratadas con dox o Dox-NP en condiciones idénticas. Dentro de minutos de exposición de dox, DXR nuclear puede observarse (Figura 3A, 1 película) y, utilizando una menor ganancia (insertar), puede verse intercalando en el núcleo. En cambio, cuando se exponen a Dox-NP, DXR intracelular es apenas visible dentro de este marco de tiempo (figura 3B, película 2). Sólo mediante el aumento de la ganancia del fotomultiplicador, DXR en el citoplasma puede observarse (insertar). Utilizar ImageJ, analizaron la densidad de píxeles de DXR citoplásmica y nuclear. Como las células están en movimiento durante la evaluación de lapso de tiempo, es importante combinar los fluorescentes con imágenes de campo claro. Esto presenta la posibilidad de seguimiento de las células individuales y estabilizar la deriva XY usando plugins específicos en ImageJ. En el análisis presentado en la figura 3, la imagen de campo claro se utiliza para dibujar una región de interés (ROI) en el citoplasma (línea sólida) y el núcleo (línea punteada). El Gerente de ROI en ImageJ puede encontrarse en el menú Analyze > herramientas > Gerente de ROI. Los ROIs se utilizan en la imagen fluorescente para analizar densidad de píxeles mediante la opción del menú Analyze > medida. La diferencia entre la densidad de píxeles en el núcleo (figura 3) y el citoplasma (figura 3D) de las células tratadas dox o con Dox-NP confirma lo que se ve en las imágenes. Además, las células fueron incubadas durante 24 h con dox o Dox-NP, después de que el compuesto fue reemplazado por medio y reflejado inmediatamente con el aumento de la sensibilidad de la ganancia del fotomultiplicador (figura 4). Otros ámbitos, como la energía del laser, offset, agujero de alfiler y visualización de imágenes, eran idénticos. Es sorprendente la baja señal DXR en Dox-NP-células tratadas con respecto al Tratado de dox. Con una ganancia de 700, DXR en las células tratadas con Dox-NP se hace visible, mientras que la imagen de dox ya está sobreexpuesta. Este experimento simple en vitro visualiza una diferencia significativa en la biodisponibilidad de libre versus droga encapsulada. Cuando las células están continuamente expuestas a Dox-NP durante 24 h, DXR se acumula con el tiempo, como se muestra en la figura 5A y películas 3 y 4. La señal aumenta en el citoplasma, y más tarde, DXR también se encuentra intercalada en el núcleo. Estas observaciones son confirmadas por las gráficas de densidad de píxeles (figura 5B). La densidad de píxeles citoplásmico medido es menor en BLM en comparación con las células 1F6 debido a la diferencia en la distribución intracelular. Mientras que DXR en células 1F6 se distribuye a lo largo de la célula, DXR en células BLM está más concentrado en un organelo cerca del núcleo (figura 5). Por lo tanto, se investigó la localización de drogas y portador en diferentes líneas celulares (figura 6). Las células fueron incubadas durante 24 h con Dox-NP/hizo y reflejada. Usando la imagen de campo claro, un recubrimiento de la membrana celular (línea sólida) y núcleo (línea punteada) fue dibujado en la imagen fluorescente de tres diferentes líneas celulares. Se demuestra aquí que el portador, con lo hizo, sigue el mismo patrón citoplásmico como DXR: concentra en un organelo cerca del núcleo de BLM, alrededor del núcleo entero en LLC y esparcidas al azar por todo el citoplasma en las células B16BL6. En el núcleo, sólo DXR y no lo hizo puede verse, indicando lanzado dox. Al reducir la ganancia del fotomultiplicador, vesículas celulares individuales que contienen DXR y el portador, con lo, así como con el CF-PE (figuras 6B y 6C), se pueden ver. DXR citoplásmico secuestra en pequeñas vesículas y células fueron etiquetadas con un marcador lisosomal de células vivas en verde o rojo. Puede seguir el movimiento de estos lisosomas en las células (película 5). DXR citoplásmico y el nanocarrier colocalize dentro de estas estructuras, y la diferencia intercelular en el patrón DXR, como se ve en la figura 6, se explica aquí. Lisosomas se distribuyen al azar por todo el citoplasma en B16BL6 y se encuentran cerca del núcleo en las células de la BLM (Figura 7A). Utilizar ImageJ, la colocalización entre DXR y portador en el lisosoma se calculó (figura 7B). Las imágenes de color se hicieron binario (proceso de > binario > binario hacer) y con el plug-in de colocalización (analizar > colocalización), se hizo una imagen de colocalización de DXR con hizo. Esto crea una imagen de color verde-rojo-blanco, con píxeles blancos que representan los píxeles colocalized de ambas imágenes. A través del menú artículo proceso > binario > hacer binario, los píxeles blancos se separó y convierten a píxeles negros, de los cuales se mide la densidad de píxeles (analizar > medida). Después de eso, se hizo una imagen de colocalización entre este DXR-de la imagen y la imagen binaria del marcador lisosomal (LM) y la densidad de píxeles medidos. Los datos de colocalización están el porcentaje de píxeles positivos para DXR-hizo y marcador DXR-hizo/lisosomal (figura 7). Que el portador, etiquetado con el CF-PE, así como lo hizo, se encuentra en el lisosoma también se muestra en la figura 7. Figura 1: instrumentos y equipos configuración. A) imágenes cámara + necesidades. vidrio de cubierta #1 de 25 mm (1), parte inferior de la cámara (2), superior de la cámara (lugard arriba hacia abajo) y junta tórica (3), titular de la etapa (4) y cierre la tapa (5). Barra de escala: 2 cm. B) unidad de incubación. Platina del microscopio climatizada (1), flujo etapa con en – y hacia fuera – flujo de CO2 (2), una sonda de2 CO (3) y un parche de cierre (4). Barra de escala: 2 cm. C) imágenes cámara en la unidad de incubadora, como se ha visto bajo el microscopio. D) macro de la serie y tiempo. E) equipo para la proyección de imagen. Invertido microscopio (1), luz fluorescente (2), informática (3), calentador de anillo (4, insertar) y controlador (Figura 4, principal), tubería de flujo de CO2 (5), CO2 válvula (6), controlador de CO2 (7), CO2 humidificador (8), O la válvula2 y regulador (9) y regulador de temperatura de la etapa (10). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: esquemática de los parámetros de microscopio en protocolo sección 3. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: investigando la captación a corto plazo de dox y Dox-NP.  Células BLM fueron expuestas continuamente a dox o Dox-NP 3 h, y un time-lapse fue tomado. (A) fotografías de Time-lapse de las células que se incubaron con dox. (B) fotografías de Time-lapse de las células se incubaron con Dox-NP. Barra de escala = 50 μm. (C) píxeles densidad aumento de DXR nuclear en células tratadas dox y con Dox-NP. (D) aumento de densidad de píxeles de DXR citoplasmática en células tratadas dox y con Dox-NP. Los datos representan la media ± SD de 3 células por campo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: investigar la absorción a largo plazo de dox y Dox-NP en diferentes líneas celulares. Las células fueron expuestas a dox o Dox-NP e imagen 24 h más tarde. Imágenes fueron tomadas inmediatamente después del retiro de las drogas, con 3 diferentes ganancias. Barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: investigar la absorción celular y liberación de agentes liposómicos. Las células fueron expuestas continuamente a Dox-NP durante 24 h, y un time-lapse fue hecho. (A) imágenes fijas de los time-lapse. Barra de escala = 50 μm. (B) píxeles densidad aumento de DXR en el núcleo y el citoplasma. Los datos representan la media ± SD de 3 células por campo. Imágenes (C) demostrar la localización de DXR dentro de la célula. Línea sólida: membrana celular, línea punteada: núcleo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: investigar la localización de drogas y portador en líneas celulares diferentes. (A) las células fueron expuestas a Dox-NP/24 h y reflejadas. Barra de escala = 50 μm. (B) las células fueron expuestas a Dox-NP/hizo/CF-PE durante 24 h y reflejadas con una ganancia de intensidad baja para distinguir las vesículas individuales. (C) el campo brillante y DXR superposición mostrando DXR en vesículas citoplasmáticas (flecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 7: investigación de la localización intracelular de la droga y portador de. Las células fueron expuestas a Dox-NP/hizo o CF-PE/lo hizo por 24 h, y lisosomas se visualizan mediante el marcador lisosomal de células vivas (LM) en color verde o rojo. (A) localización intracelular de DXR y el portador (lo hizo). Las flechas representan 3 ejemplos de DXR e hicieron localizadas en el lisosoma. Barra de escala = 50 μm. (B) análisis co-localización de DXR y el portador (hizo) en los lisosomas (LM) con ImageJ. (C) porcentaje de co-localización de DXR y el portador en los lisosomas. Los datos representan la media ± SEM de 3 experimentos individuales. (D) el secuestro Lysosomal del portador había visualizado usando dos diferentes marcadores. Barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Película 1: relacionados con Figura 3 : Las células de la BLM se incubaron con dox para 3 h. Time-lapse: 19 imágenes, con un intervalo de 10 minutos de fotogramas: 3 fps. Barra de escala = 50 μm. por favor haga clic aquí para ver este vídeo. (Clic derecho para descargar) Película 2: relacionados con Figura 3 : Las células de la BLM se incubaron con Dox-NP para 3 h. Time-lapse: 19 imágenes, con un intervalo de 10 minutos de fotogramas: 3 fps. Barra de escala = 50 μm. por favor haga clic aquí para ver este vídeo. (Clic derecho para descargar) Película 3: relacionados con Figura 5 : Las células de la BLM se incubaron con Dox-NP para 24 h. Time-lapse: 96 imágenes, con un intervalo de fotogramas de 15 min.: 8 fps. Barra de escala = 50 μm.objetivo vi”=”_blank”> haga clic aquí para ver este video. (Clic para descargar). Movie 4: relacionados con Figura 5 : 1F6 células fueron incubadas con Dox-NP durante 24 h. Time-lapse: 96 imágenes, con un intervalo de fotogramas de 15 min.: 8 fps. Barra de escala = 50 μm. por favor haga clic aquí para ver este vídeo. (Clic derecho para descargar) Movie 5: relacionados con Figura 7 : Lisosomas de B16BL6 células fueron teñidas con un marcador de células vivas. Time-lapse: 10 imágenes, con un intervalo de 10 s. tarifa de marco: 3fps. Barra de escala = 50 μm. por favor haga clic aquí para ver este vídeo. (Clic derecho para descargar)

Discussion

Según lo observado en el pasado, la fijación puede destruir nanocarriers liposomal casi inmediatamente y DXR lanzado estos liposomas destruidos todavía tenían el tiempo para entrar en el núcleo, de forma que la interpretación de datos muy difícil e incluso engañosa. Con algunos ajustes microscópicos, sino quimioterápico en las células vivas y tejidos puede investigarse rutinariamente para confirmar o derrocar observaciones histológicas. Un trabajo reciente demostró la absorción, liberación y localización de DXR en células tratadas con dox libre y encapsulado utilizando células vivas Time-lapse imagen9. Este trabajo describe el montaje experimental con más detalle. Utilizando este modelo, es posible visualizar el transporte inmediato de dox al núcleo, donde se acumula continuamente hasta que la célula finalmente muere. En cambio, cuando se utiliza Dox-NP, sólo pequeñas cantidades de dox liberado se encuentran en el núcleo. Aunque continua exposición resulta en acumulación continua de DXR, la señal fluorescente es mucho menor en Dox-NP-versus células tratadas con dox, indicando una diferencia en la concentración celular y citotoxicidad posterior. Además, mediante el uso de marcadores de células vivas, fue demostrado que, al exponer las células a Dox-NP, DXR y el nanocarrier se encuentran en el lisosoma. Esto indica que el liposoma completa es tomado por la célula y muestra la implicación de una vía endocíticas durante la captación de estas nanopartículas. El DXR en el núcleo es claramente de dox liberado. Sin embargo, usando este método, como el DXR y portador co localización y parecen estar atrapados en los lisosomas, es todavía poco concluyentes si esto se encapsula o lanzado dox. Es posible que la estabilidad intrínseca de la nanopartícula evita la liberación de dox cuando localizadas en el lisosoma.

En este protocolo, proyección de imagen de células vivas se demuestra mediante una específica configuración microscópica, con un soporte de fase por encargo (las especificaciones se pueden dar bajo petición). Sin embargo, más fabricantes de microscopio confocal ofrecen una gama de incubadoras que realizar proyección de imagen de células vivas. Preservar las condiciones de cultivo de células (es decir, temperatura, CO2, pH, humedad y esterilidad) es el criterio principal de estas incubadoras y requiere algunas pruebas preliminares para determinar las condiciones adecuadas, que se explicó. Programas de adquisición de datos también pueden ser entregados por los mismos fabricantes. Una opción de “Multi ubicación” hace posible para varios puestos en la misma cámara, la imagen refinado análisis estadístico. Sin embargo, esta opción en la macro en este manuscrito requiere posiciones fijas de XYZ, por la que se pierde la posibilidad de corregir para la deriva de Z. Análisis de la dimensión Z pueden incluirse en este macro y utiliza un enfoque plano para el análisis. Sin embargo, esto requiere análisis adicionales, aumentando la posibilidad de fototoxicidad y blanqueo.

Como con todas las medidas fluorescentes, sobreexposición es un problema, especialmente cuando se comparan dos compuestos con un diferente absorción celular. La intensidad fluorescente no depende sólo la señal intrínseca del compuesto, sino también la tasa de absorción, la concentración y el tiempo de exposición de la droga. Como se muestra en la figura 3, el contenido nuclear de DXR de células tratadas con dox ya es visible, mientras que ninguna señal se observa en células tratadas con Dox-NP. Sólo mediante el aumento de la ganancia puede DXR en células tratadas con Dox-NP visualizarse, conduce a la sobreexposición en células tratadas con dox. Por otra parte, incluso intracelularmente, Dox-NP es heterogénea, que puede dar lugar a inevitables bajo- o sobreexposición. Especialmente al investigar la captura celular de DXR, la ganancia se redujo significativamente para distinguir los organelos (figuras 5B y 5C). Por lo tanto, las mediciones representadas por la densidad de píxeles deben acompañarse de las imágenes representativas para la correcta interpretación de los resultados.

Fototoxicidad, blanqueo y un cociente signal-to-noise bajo también son temas importantes en microscopía fluorescente, y debe establecerse un compromiso entre la calidad de la imagen y la adquisición de la imagen. Sin embargo, incluso cuando la configuración del microscopio es óptima, la calidad de imagen está también determinada por la calidad de las células y el compuesto añadido. DXR da una señal fuerte y, con las precauciones apropiadas, blanqueo no se observó, incluso después de largos periodos (hasta 72 h). Sin embargo, la reducción de la señal fluorescente también puede ser consecuencia de la emanación. La emanación es un fenómeno importante en drogas resistencia15 y ocurre cuando las células bombear la droga desde el sitio intracelular de acción. Una disminución de la señal fluorescente en el tiempo por lo tanto también puede ser consecuencia de la emanación de dox9. Comparación de la señal fluorescente de un lugar no explorado en el final del experimento con la última imagen de la serie Time-lapse demostrará blanqueo (es decir, la señal será más alta en el lugar no explorado) o emanación (es decir, ambos señales serán idénticas). Están disponibles en programas como el ImageJ16varias opciones correccionales (p. ej., antecedentes, deriva, blanqueo, etc.). También, como la intensidad fluorescente aumenta con el tiempo, los valores de configuración pueden ser previamente evaluados en un experimento piloto para minimizar la exposición al final del lapso de tiempo (paso 3.21). Alternativamente, puede utilizarse una cámara de proyección de imagen con las células ya expuestos a la droga para el período de tiempo deseado para inicializar la configuración. Finalmente, para este tipo de análisis, concentraciones de la droga tóxica (paso 3.22) deben ser evitadas y había preestablecida usando bio-análisis convencionales.

Las células son continuamente cultivadas y mantenidas en medio sin rojo de fenol. Rojo de fenol es en la parte roja del espectro y se observan organelos celulares, probablemente lisosomas, presentando información de falsos positivos (paso 1.2). Para permitir el monitoreo de células individuales, confluencia celular no debe exceder 70% (paso 3.1.). El CO2 -velocidad de flujo (paso 3.5) debe ser regulado en un experimento de validación cuando el equipo es adquirido o después del mantenimiento. Cuando la velocidad es demasiado alta, medio se evaporará. Cuando la velocidad es demasiado baja, se incrementará el pH del medio, que puede afectar el crecimiento de la célula. Como el medio es sin los cambios de indicador de pH rojo de fenol pH no pueden ser observados y por lo tanto son fácilmente ignorados. Una vez que se valida el flujo de CO2 , esta configuración puede utilizarse en todos los experimentos futuros.

Utilizando el método descrito aquí, el destino de nanopartículas puede fácilmente ser investigado usando proyección de imagen de células vivas y microscopia Time-lapse. En este procedimiento, se utilizaron nanopartículas disponibles comercialmente. Sin embargo, el destino de termosensible17, liposomas catiónicos10; liposomas con shingolipids de cadena corta de18; y encapsulación de nanopartículas otras drogas también fueron investigados8,19 de esta manera en el tumor y las células normales.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Las instalaciones de microscopía utilizadas son parte del centro de la proyección de imagen óptica de Erasmus, y nos gustaría agradecer al personal de la OCI por sus servicios.

Materials

DMEM (no phenol-red) Sigma D1145 Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS
Trypsin-versene (EDTA) Lonza BE17-161E
Fetal calf serum Sigma F7524 Heat inactivate for 30 min at 55 ºC
L-Glutamin Lonza BE17-605E
Gelatin from bovine skin Sigma G9391 Make a 0,1% solution in PBS, sterile
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma D8537
Stericup 0,22 µm filter – 500 ml  Millipore SCGPU05RE
Trypan-blue Sigma T8154
Cells: Lewis lung carcimoma ATCC CRL-1642
Cells: B16BL6 Dr. P. Brouckaert, Ghent University donated Ref.10
Cells: BLM and 1F6 Dr. van Muijen, University of Nijmegen donated Ref.11
Petri dish Greiner 664160
Doxorubicin Actavis  mentioned as dox in the manuscript
Doxil/Caelyx Janssen-Cilag mentioned as Dox-NP in the manuscript
Syringe filter 0.2 µm VWR international 10462200
Lysotracker-green DND-26 Invitrogen L7526 mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript
Lysotracker-red DND-99 Invitrogen L7528 mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript
Attofluor cell ring Invitrogen A7816
Cover glass 25 mm #1 Thermo scientific CB00250RA1
Stage holder + sealing lid Custom made
ZEISS LSM 510 microscope Zeiss
Software LSM 510 version 3.2 SP2 Zeiss
Image J NIH https://imagej.nih.gov/ij/index.html
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References

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Seynhaeve, A. L., ten Hagen, T. L. Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles. J. Vis. Exp. (129), e55405, doi:10.3791/55405 (2017).
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