体外配信生細胞イメージング化学療法を探求する脂質ナノ粒子によってを使用してください。

別のマーカーとリポソーム キャリアの分類は上記9をされています。キャリア付けられて遠 dioctadecyl tetramethylindotricarbocyanine 過塩素酸塩 (でした。Ex = 644 nm;Em = 665 nm) または緑 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) (CF PE;Ex = 490 nm;Em = 515 nm) この原稿で示されます。細胞間の類似点とリポソーム取り込み、リリース、および細胞内局在の違いを表示するには、複数の腫瘍のタイプを調べた。マウスの 2 つの行、B16BL6 悪性黒色腫11とルイス肺癌 (LLC) と 2 つのひと黒色腫、転移性の高い (BLM)、非転移性 (1F6) 悪性黒色腫12,13が含まれます。生きた細胞を用いるすべての実験を行った。すべての実験で 3 24 の h. 測定や分析 dox (無料、リリースされた、カプセル化、隔離、または介在の形態) で呼ばれた DXR の 5 μ g/mL dox、5 μ G/ml、Dox NP または 0.05 µmol ナノ粒子の濃度が投与されました。40 X (開口数: 1.3) 油対物レンズが使用され、CF PE とライソゾーム マーカー (LM) のイメージングを行った 488 nm アルゴン レーザー (10%/0.2 mw) と 505 に 550 nm バンドパス フィルター-緑。543 nm ヘリウム ネオン レーザー (100%/0.2 mw) 560 に 615 nm のバンドパス フィルターを用いて dox、Dox NP とライソゾーム マーカー赤と。633 nm ヘリウム ネオン レーザー (100%/0.5 mw)、640 nm ロングパス ・ フィルターを用いていた。 そのカプセル化のため生体外の細胞毒性、バイオアベイラビリティ、dox の薬物動態は、大幅に変更された3,9,14をだった。無料でカプセル化された形で投与したときの薬物のバイオアベイラビリティの差は、図 3に示されています。Dox はデュアルインターカレーション エージェントを細胞に細胞核を入力する必要があります。図 3と関連映画の 1 と 2 は、3 h を同一条件下で dox と Dox NP BLM 細胞の時間経過の表示に。Dox 露出の数分以内核 DXR (図 3 a映画 1) を観察することができ、下を使用して (挿入) を得るため、核の間をインターカ レートを見ることができます。一方、Dox NP にさらされると、細胞内 DXR は、(図 3 b映画 2) この時間枠の内でほとんど見えないです。光電子増倍管の利得を増やすだけで細胞質に DXR を観察できる (挿入)。ImageJ を用いた、細胞質と核の DXR のピクセル密度を行った。細胞は、運動、時間経過の評価中に、蛍光を明視野画像を組み合わせることが重要です。これは、個々 のセルを追跡し、ImageJ で特定のプラグインを使用して XY ドリフトを安定化の可能性を示します。図3 における、明視野イメージは利益 (率 ROI) (実線) の細胞質と核 (点線) の周りの領域を描画に使用されました。ImageJ で ROI マネージャーは、メニュー項目分析で見つけることができます > ツール > ROI マネージャー。これらの Roi はメニュー項目分析を使用してピクセル密度を分析する蛍光画像で使用される > メジャー。核 (図 3) のピクセル密度と dox または Dox-NP-処理細胞の細胞質 (図 3 D) の違いは、画像で見ているものを確認します。また、セル dox または後化合物は媒体に置き換え、光電子増倍管の利得 (図 4) の高められた感度ですぐに結像される Dox NP で 24 時間培養。レーザー出力、オフセット、ピンホール、画像表示などの他の設定は同一であった。Dox NP 処理 dox 治療に比べて細胞で DXR 信号が印象的です。700 のゲインを使用、Dox NP 処理細胞で DXR が dox のイメージは既に露出オーバーに対し、表示されます。この単純な生体外実験では、カプセル化された薬剤と無料のバイオアベイラビリティの差を可視化します。 細胞が 24 h の Dox NP に継続的にさらされる、DXR 造り上げる、図 5 aと映画 3 と 4 で示すように。信号が細胞質の増加し、DXR 発見が遅くまた核に挟在します。これらの観察は、ピクセル密度グラフ (図 5 b) で確認しています。測定された細胞質ピクセル密度は BLM 1F6 細胞に比べて細胞内分布の違いのために低いです。DXR 1F6 セルでは、セル全体に分散され、一方 BLM セルの DXR はより核 (図 5) に近い細胞小器官に集中してください。 そのため、薬と異なる細胞 (図 6) のキャリアの局在を調べた。Dox NP/したとイメージで 24 時間培養し, 細胞。明視野イメージを使用して細胞膜 (実線) と核 (点線) のオーバーレイは、3 つの異なる細胞の蛍光像で描かれました。ここで付いた、キャリア、DXR と同じ細胞質パターンに従うこと示されて: LLC は、全体の核の周り, BLM の原子核に近い細胞小器官に集中し、ランダムに B16BL6 細胞の細胞質に散在します。核でのみ DXR として見ることができる、dox を解放を示します。光電子増倍管の利得を減らして、DXR と付けられてキャリアを含む個々 の細胞小胞でしたと同様、CF-PE (図 6 b ・ 6 C) と見ることができます。 小さい小胞の細胞質 DXR sequesters し、セルは緑または赤で生きている細胞のライソゾーム マーカーで付けられました。これらのリソソームの動きは、セル (映画 5) で続くことができます。細胞質 DXR と、ナノキャリアはこれらの構造の内で colocalize し、DXR パターンで細胞間差図 6に見られるように、ここで説明します。リソソームは、B16BL6 細胞質全体にランダムに分散し、BLM 細胞 (図 7 a) の核に位置しています。ImageJ を用いた、DXR とリソソーム内のキャリアの間の共存を求めた (図 7 b)。カラー画像はバイナリで行われた (プロセス > バイナリ > バイナリを作る)、プラグインの共存を使用して (分析 > の共存)、共存イメージと DXR の作られたでした。これは両方の画像のコードして, ピクセルを表す白いピクセル グリーン赤白カラーの画像を作成します。メニュー項目のプロセス > バイナリ > バイナリを作る、白いピクセルを分離し、ピクセル密度の測定元となる黒のピクセルに変換する (分析 > 測定)。この DXR 間共存イメージがしましたその後、-イメージしたし、ライソゾーム マーカー (LM) とピクセル密度のバイナリ イメージを測定します。共存に関する研究データは DXR の肯定的なピクセルの割合-でしたと DXR でした/ライソゾーム マーカー (図 7)。CF PE で標識されたキャリアと同様は、リソソームの位置も、図 7に表示されます。 図 1: 楽器と機器のセットアップ。A) イメージング室 + 必需品。25 mm #1 カバーガラス (1) 商工会議所 (2) の下の部分 (場所の部屋の上部します。下逆さま d)、o リング (3)、ステージ ホルダー (4)、シール蓋 (5)。スケール バー: 2 cm。 B) インキュベーション ユニット。加熱顕微鏡ステージ (1) フローとで- とアウト-flow CO2 (2)、(3) CO2プローブおよび終了パッチ (4)。スケール バー: 2 cm。 C) 顕微鏡の下で見られるようにインキュベーター ユニットでチャンバーをイメージングします。D) マルチ時間シリーズ マクロ。E) イメージング装置です。逆顕微鏡 (1)、蛍光灯 (2)、コンピューター (3)、リング ヒーター (4、挿入) とコント ローラー (4、主要な図)、CO2流管 (5)、CO2バルブ (6)、CO2コント ローラー (7), CO2加湿器 (8) O2バルブとコント ローラー (9) とステージ温度コント ローラー (10)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 2:プロトコル セクション 3 で細かいパラメーターを顕微鏡の概略図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3: dox と Dox NP の短期的な摂取量を調査します。 BLM 細胞が 3 h、dox または Dox NP にさらさ継続的に、経過時間をとった。(A) dox と培養細胞のコマの静止画像。(B) 細胞のコマの静止画像は、Dox NP と孵化させます。スケールバー = 50 μ m (C) ピクセル密度増加額 dox と Dox-NP-処理細胞で核の DXR の。(D) dox と Dox-NP-処理細胞の細胞質の DXR のピクセル密度増加。データは、フィールドごとの 3 セルの平均 ± SD を表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 4: 細胞 dox と Dox NP の長期的な摂取量を調査しています。細胞は dox または Dox NP にさらされ、後で 24 h をイメージします。3 異なる利益と、薬を除去した後すぐに撮影を行った。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 5: 細胞内取り込みとリポソームのエージェントのリリースを調べるします。細胞は、24 時間、Dox NP に継続的にさらされ、コマ撮りしました。(A) コマ撮りの静止画。スケール バー 50 μ m (B) ピクセル密度の増加額 DXR の核と細胞質を =。データは、フィールドごとの 3 セルの平均 ± SD を表します。(C) 画像をセル内で DXR の局在を示します。実線: 細胞膜、点線: 核。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 6: 薬と異なる細胞株におけるキャリアのローカライズを調査します。(A) 細胞が Dox NP/ー 24 時間にさらされているし、イメージします。スケールバー = 50 μ m。 (B) 細胞 24 h の Dox-NP/か/CF-PE にさらされる, 個々 の小胞を区別するために低強度の利得を持つイメージを作成します。(C) ブライト フィールド、DXR の細胞質小胞 (矢印) で DXR を示すオーバーレイします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 7: 薬物とキャリアの細胞内局在化の調査。セルは、Dox NP/でしたか CF-PE/24 時間にさらされ、リソソームが緑または赤の生きている細胞のライソゾーム マーカー (LM) を用いて可視化します。DXR と (した) キャリアの細胞内分布 (A)。矢印は、DXR の 3 例を表し、リソソームでローカライズされたでした。スケールバー = 50 μ m (B) の共局在解析において, dxr と ImageJ を用いたリソソーム (LM) にキャリア (でした)。DXR の共局在およびリソソームにキャリアの (C) の割合。データは、3 の個々 の実験の平均 ± SEM を表します。2 つのマーカーを用いて可視化するキャリアの (D) ライソゾーム隔離。スケールバー = 50 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 映画 1: 関連図 3:3 h の dox と BLM 細胞培養コマ撮り: フレーム レートを 10 分の間隔で、19 画像: 3 fps。スケールバー = 50 μ m.してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード) 映画 2: 関連図 3:3 h の Dox NP の BLM 細胞培養コマ撮り: フレーム レートを 10 分の間隔で、19 画像: 3 fps。スケールバー = 50 μ m.してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード) 映画 3: 関連する図 5:24 時間の Dox NP の BLM 細胞培養時間経過は: フレーム レートを 15 分間隔で 96 画像: 8 fps。スケールバー = 50 μ m。vi”ターゲット =”_blank”> このビデオを表示するのにはここをクリックしてください。(右クリックしてダウンロード)。 映画 4: 関連図 5: 1F6 細胞 Dox NP で培養し, 24 時間時間経過は: フレーム レートを 15 分間隔で 96 画像: 8 fps。スケールバー = 50 μ m.してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード) の映画 5: 関連図 7:リソソーム B16BL6 細胞の生細胞マーカーが染まった。時間経過は: 10 の間隔で 10 の画像 s のフレーム レート: 3 fps。スケールバー = 50 μ m.してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)