שימוש במבחנה לחיות תאים הדמיה כדי לחקור Chemotherapeutics מועברת על ידי חלקיקים המבוססת על שומנים בדם
Summary
הדמיה לחיות תאים הוא כלי רב עוצמה כדי לחזות תהליכים דינאמיים. הבחינה של תאים קבוע מספק רק תמונות סטטיות, אשר יכול להוביל פירוש מוטעה ובלבול לגבי התהליך. עבודה זו מציגה שיטה ללמוד ספיגת התרופה שחרור, לוקליזציה תאיים של חלקיקים liposomal בתאים חיים.
Abstract
טכניקות הדמיה שגרתיות יכול לספק מידע מפורט אודות תהליכים תאיים. עם זאת, מידע זה מבוסס על תמונות סטטיות בכל מערכת אחרת דינמי, שלבים רצופים בקלות להתעלם או שלא כהלכה. הדמיה לחיות תאים, מיקרוסקופ זמן לשגות, שבו תאים חיים יכול להיות בעקבות שעות או אפילו ימים באופן רציף יותר או פחות, ולכן הם מאוד אינפורמטיבי. הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר החקירה על גורלם של חלקיקים כימותרפיות לאחר המסירה של דוקסורוביצין (dox) בתאים חיים. Dox הוא סוכן intercalating זה חייב להשתחרר מן nanocarrier שלה להיות פעילים ביולוגית. למרות רישומה קלינית במשך יותר משני עשורים, את ספיגת, התמוטטות, ושחרור סמים הם עדיין לא מובן במלואו. מאמר זה בוחן את ההיפותזה חלקיקים המבוססת על השומנים שנלקחה על ידי תאים סרטניים והשפילו הם לאט לאט. Dox שפורסמו אז translocated את הגרעין. כדי למנוע קיבוע חפצים, הדמיה לחיות תאים, מיקרוסקופ זמן לשגות, המתוארות בהליך זה ניסיוני, יכול להיות מיושם.
Introduction
היכולת לעקוב אחר תהליך ביולוגי, כגון תאים תאים אינטראקציות, אינטר-תחבורה תאיים, ספיגת מתחם ציטוטוקסיות ואת אינטראקציית חלבון של מולקולות יחיד בתוך החיים תאים ורקמות, צברה עניין רב במהלך האחרון עשור, כפי שהיא מספקת המימד הנוסף של “בזמן אמת”. כתב יד זה, מתוארת שיטה כדי לעקוב אחר גורלם תאיים dox חינם ו dox שולבו חלקיקים (Dox-NP).
חלקיקים שימשו במשך עשרות שנים לטיפול סרטן מסוימים. Dox-NP אושרה לטיפול סרקומה קפוסי הקשורות לאיידס, מתקדם השחלות, השד סרטן, מיאלומה נפוצה1. זה היה אחד של חלקיקים liposomal הראשון פיתח והציג בסביבה קלינית. הצורה החופשית, dox, מנוקה במידה רבה של מחזור הדם, הגבלת הקיבולת שלו כדי להגיע לאתר הגידול בכמויות מספיקות. יתר על כן, טיפול זה מלווה חמורה והגבלת מינון תופעות לוואי, כגון stomatitis ואי ספיקת לב. כאשר מקופל לתוך pegylated liposomal חלקיקים זרימת הזמן מגביר דקות ימים2. סוג זה של כולסטרול המכילים ליפוזום היא די יציבה, יציבות זו קובעת את פרמקוקינטיקה של התרופה במארז.
עם זאת, קשיחות זו יש חיסרון. היכולת ציטוטוקסיות של תרכובת לכיוון תאים סרטניים הוא הראשון הערכה במבחנה, הוכח ש-dox הזה הוא יותר חזק ממה Dox-NP בציטוטוקסיות מבחני3,4. זה היה שיערו כי היציבות של המוביל מונע שחרור, ספיגת הסלולר של הסם, כדאי לחקור את התופעה הזו עוד יותר. המאפיינים liposomal מהותי, נבנה אחרונה המרכיבים אגרסיביות בזרם הדם ולהגיע לאתר הגידול ללא פגע, גרמו הביולוגית לקוי של הרכיב ציטוטוקסיות (קרי: dox) באתר היעד (קרי, הגידול גרעין התא). למרות Dox-NP דיברת שיפור התגובה לעומת הצורה החופשית, זה היה עדיין בעל ערך קליני, כמו עטיפת הקטינה באופן משמעותי את ההשפעות cardiotoxic5. בשנים הבאות, תרכובות אחרות היו אנקפסולציה ננו-נשאים6. בנוסף, שינוי נשאים, גרמו סמים מופעלות שחרור (קרי, באתר הגידול) אך שמר על יציבות ב-7,זרימת הדם8. למרות שנים של חקירה, שימוש קליני, גורל intratumoral nanocarriers כמו Dox-NP עדיין לא ברורות לגמרי בפרסום האחרון, זה הוצג כי ננו-חלקיק הוא נלקח כולו בעוד dox נשאר לכוד ב lysosomes9.
ספיגת הסלולר של שחרור nanoparticle וסמים הם תהליכים דינאמיים שניתן בצורה הטובה ביותר לפקח עליהם באמצעות הדמיה לחיות תאים. יתר על כן, היסטולוגיה קלאסי, שבו תאים מודגרת, לאחר מכן קבועה, יכול לתת תוצאות שגויות אם הקיבעון הורס המוביל liposomal ומציג חפצים. הדרישה המרכזית הדמיה לחיות תאים הוא חזותי, רצוי על ידי קרינה פלואורסצנטית, של התהליך הרצוי. תרכובות מסוימות, כמו dox, יש של פלואורסצנטי אדום פנימי. כמו כן, סמני פלורסנט יכולה להיות מוחדרים המוביל, האברונים ניתן לאבחן באמצעות סמנים לחיות תאים. בדרך זו, מערך של פרמטרים, כמו ספיגת של המוביל, שחרור התרופה, לוקליזציה הסלולר של הספק ושל סמים, יכול להיות עם תמונה, מנותח. . הנה, שיטה מתואר שבו המערכת גורל dox ו Dox-NP בתאי הגידול במספר מלווה בזמן אמת. בנוסף, שיטה זו ניתן להתאים בקלות ליצור תנאים אידיאליים עבור ממוקד (למשל, טעונה חלקיקים10) ועורר שחרור התרופה (למשל, היפרתרמיה7).
Protocol
Representative Results
Discussion
כפי שנצפו בעבר, קיבוע יכול להרוס liposomal nanocarriers כמעט מיד, חייה של DXR שוחררה טופס אלה נהרסה ליפוזומים עדיין היה לי זמן להיכנס לגרעין, שהופך את הפרשנות של נתונים קשה מאוד אפילו מטעה. עם כמה שינויים מיקרוסקופיים, גורל כימותרפיות חיים תאים ורקמות ניתן באופן שגרתי ייבדקו כדי לאשר או להפיל את התצפיות היסטולוגית. עיתון האחרונות הראו את ספיגת שחרור, לוקליזציה של חייה של DXR בתאים לטפל בעזרת dox בחינם, שעברו אנקפסולציה באמצעות הדמיה בצילום מואץ לחיות תאים9. עבודה זו מתארת את הגדרת הניסוי בפירוט רב יותר. באמצעות מודל זה, אפשרי לדמיין את הובלת מיידית dox את הגרעין, איפה זה ברציפות מצטבר עד התא ימות בסופו של דבר. לעומת זאת, כאשר נעשה שימוש Dox-NP, רק כמויות קטנות של dox המשוחררים נמצאים בגרעין. למרות חשיפה מתמשכת תוצאות הצטברות חייה של DXR רציפה, האות פלורסנט הוא נמוך בהרבה ב Dox-NP-לעומת תאים שטופלו dox, המציין הבדל ריכוז הסלולר לבין cytotoxicity הבאים. יתר על כן, באמצעות סמנים לחיות תאים, זה הוצג, בעת חשיפת לתאים Dox-NP, חייה של DXR את nanocarrier ממוקמים על ליזוזום. אפשרות זו מציינת ליפוזום מלאה הוא נלקח על ידי התא ומדגים במעורבות מסלול endocytic במהלך ספיגת של חלקיקים אלה. חייה של DXR בגרעין ברור מן המשוחררים dox. באמצעות שיטה זו, כמו חייה של DXR והן המוביל לשפה משותפת ולא נראה להיות לכודים בתוך lysosomes, זאת עדיין חד משמעית אם זה עוברת אנקפסולציה או משוחרר dox. זה אפשרי כי יציבות פנימית ננו-חלקיק מונע שחרור dox כאשר מותאמים לשפה את ליזוזום.
ב פרוטוקול זה, הוכח הדמיה לחיות תאים באמצעות מלכודת מיקרוסקופיים ספציפי, בעל שלב בהזמנה אישית (המפרט יכול להיות נתון על פי בקשה). עם זאת, מייצרת מיקרוסקופ קונפוקלי ביותר מציעים מגוון רחב של חממות לבצע הדמיה לחיות תאים. שמירה על תנאי התרבות התא (כלומר, טמפרטורה, CO2, pH, לחות ו עקרות) הוא הקריטריון העיקרי של חממות אלה ואינה דורשת כמה בדיקות מקדימות כדי לקבוע את תנאים נאותים, אשר בהמשך מוסברת. גם יכולה להיות מועברת תוכניות רכישה אוטומטית נתונים באתר לפי יצרנים אותו. אפשרות “ריבוי מיקום” מאפשרת לך תמונה במספר תפקידים בבית הבליעה אותה, זיקוק ניתוח סטטיסטי. עם זאת, אפשרות זו בפקודת המאקרו שצוין בכתב היד מחייבת עמדות XYZ קבוע, לפיו האפשרות לתיקון Z-להיסחף אובד. סריקה Z-הממד יכולים להיכלל זה מאקרו, שימושים מוקד מטוס לניתוח. עם זאת, הדבר דורש סריקה נוספת, להגדיל את האפשרות של phototoxicity, הלבנת.
כמו עם כל המדידות פלורסנט, חשיפת יתר היא בעיה, במיוחד בעת השוואת שני מתחמים עם ספיגת הסלולר שונה. עוצמת פלורסנט אינה תלויה על האות מהותי של המתחם, אלא גם על קצב ספיגת, הריכוז, ואת הזמן חשיפה לסמים בלבד. כפי שמוצג באיור 3, גרעיני חייה של DXR תוכן של תאים שטופלו dox הוא כבר גלוי, ואילו אין אות נתפסת בתאים Dox NP-שטופלו. רק על ידי הגדלת הרווח את חייה של DXR בתאים Dox NP-שטופלו ניתן לאבחן, שמוביל חשיפת יתר בתאים שטופלו dox. יתר על כן, אפילו intracellularly, Dox-NP heterogeneously מופץ, אשר יכול לגרום נמנעת תחת- או חשיפת יתר. במיוחד כאשר חוקרים את מלכודת חייה של DXR הסלולר, הרווח צומצם באופן משמעותי כדי להבחין organelles בודדים (דמויות 5B ו- 5 C). לפיכך, המידות המיוצג על-ידי צפיפות פיקסלים חייבים להיות מלווים את התמונות נציג לפרשנות הראויה של תוצאות.
Phototoxicity, הלבנה, יחס אות לרעש נמוך הם גם נושאים חשובים במיקרוסקופ פלואורסצנטי, יש ליצור פשרה בין איכות התמונה ורכישת תמונות. עם זאת, גם כאשר ההגדרה של מיקרוסקופ תהיה אופטימלית, איכות התמונה גם במידה רבה נקבעת לפי האיכות של התאים, המתחם שנוספו. חייה של DXR נותן אות חזק, עם נעשים, הלבנת לא נצפתה, גם לאחר תקופות ארוכות יותר (עד 72 שעות). עם זאת, צמצום של האות פלורסנט יכול להיות גם תוצאה של בזרימת. בזרימת תופעה חשובה ההתנגדות סמים15 , מתרחשת כאשר התאים לשאוב התרופה מאתר תאיים של פעולה. ירידה של האות פלורסנט לאורך זמן ולכן ניתן גם תוצאה של dox בזרימת9. השוואה בין האות פלורסנט של מקום שאינו סרוקים בסוף הניסוי עם התמונה האחרונה מתוך הסדרה זמן לשגות תדגים הלבנת (קרי, האות יהיה גבוה יותר במיקום שאינו סרוקים) או בזרימת (קרי, שניכם אותות יהיו זהים). קיימות מספר אפשרויות הענישה (למשל, הרקע, סחיפה, הלבנה, וכו ‘) בתוכניות כמו ImageJ16. בנוסף, ככל האינטנסיביות פלורסנט לאורך זמן, הגדרות התצורה ניתן מראש הערכה בניסוי פיילוט כדי למזער חשיפת יתר בסוף זמן לשגות (השלב 3.21). לחלופין, ניתן להשתמש תא הדמיה עם תאים כבר נחשף לסם-בתקופה הרצויה כדי לאתחל את ההגדרות. לבסוף, עבור סוג זה של ניתוח, הסם ריכוזי (שלב 3.22) להימנע והקימו מראש באמצעות ביו-מבחני קונבנציונלי.
תאים תרבותי ומתוחזק באופן רציף במדיום בלי פנול אדום. פנול אדום שזוהר בחלק האדום של הספקטרום, יכול להיות שנצפו ב- organelles הסלולר, lysosomes ככל הנראה, הצגת מידע חיובי-false (שלב 1.2). כדי לאפשר פיקוח על תאים בודדים, תא זרימה לא יעלה על 70% (שלב 3.1.). CO2 הזרימה-המהירות (שלב 3.5) צריך להיות מוסדר בניסוי אימות כאשר נרכש הציוד או אחרי תחזוקה. כאשר המהירות גבוהה מדי, בינוני יתפוגג. כאשר המהירות נמוכה מדי, יגדיל ה-pH של המדיום, אשר יכולה להשפיע על גדילת התאים. המדיום הוא ללא השינויים אינדיקטור פנול אדום pH pH לא יכול להיות שנצפו, ולכן התעלמו בקלות. ברגע הזרם2 CO מאומת, הגדרות אלה יכול לשמש כל ניסויים עתידיים.
באמצעות השיטה המתוארת כאן, גורלו של חלקיקים יכול בקלות ייחקרו באמצעות הדמיה לחיות תאים ומיקרוסקופיה זמן לשגות. בהליך זה, שימשו חלקיקים זמינים מסחרית. עם זאת, גורל thermosensitive17, ליפוזומים cationic10; ליפוזומים מועשר shingolipids קצר-שרשרת18; חלקיקים לבצע סמים אחרים8,19 נחקרו גם באופן זה גידול, תאים נורמליים.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המתקנים מיקרוסקופ המשמש חלק המרכז דימות אופטי ארסמוס, אנחנו רוצים להודות לצוות OIC עבור שירותיהם.
Materials
| DMEM (no phenol-red) | Sigma | D1145 | Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS |
| Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | |
| Fetal calf serum | Sigma | F7524 | Heat inactivate for 30 min at 55 ºC |
| L-Glutamin | Lonza | BE17-605E | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | Make a 0,1% solution in PBS, sterile |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
| Stericup 0,22 µm filter – 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
| Trypan-blue | Sigma | T8154 | |
| Cells: Lewis lung carcimoma | ATCC | CRL-1642 | |
| Cells: B16BL6 | Dr. P. Brouckaert, Ghent University | donated | Ref.10 |
| Cells: BLM and 1F6 | Dr. van Muijen, University of Nijmegen | donated | Ref.11 |
| Petri dish | Greiner | 664160 | |
| Doxorubicin | Actavis | mentioned as dox in the manuscript | |
| Doxil/Caelyx | Janssen-Cilag | mentioned as Dox-NP in the manuscript | |
| Syringe filter 0.2 µm | VWR international | 10462200 | |
| Lysotracker-green DND-26 | Invitrogen | L7526 | mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript |
| Lysotracker-red DND-99 | Invitrogen | L7528 | mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript |
| Attofluor cell ring | Invitrogen | A7816 | |
| Cover glass 25 mm #1 | Thermo scientific | CB00250RA1 | |
| Stage holder + sealing lid | Custom made | ||
| ZEISS LSM 510 microscope | Zeiss | ||
| Software LSM 510 version 3.2 SP2 | Zeiss | ||
| Image J | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/index.html |
References
- Duggan, S. T., Keating, G. M. Pegylated liposomal doxorubicin: a review of its use in metastatic breast cancer, ovarian cancer, multiple myeloma and AIDS-related Kaposi’s sarcoma. Drugs. 71 (18), 2531-2558 (2011).
- Gabizon, A., et al. Prolonged circulation time and enhanced accumulation in malignant exudates of doxorubicin encapsulated in polyethylene-glycol coated liposomes. Cancer Res. 54 (4), 987-992 (1994).
- Ten Hagen, T. L., et al. Low-dose tumor necrosis factor-alpha augments antitumor activity of stealth liposomal doxorubicin (DOXIL) in soft tissue sarcoma-bearing rats. Int J Cancer. 87, 829-837 (2000).
- Hoving, S., Seynhaeve, A. L., van Tiel, S. T., Eggermont, A. M., Ten Hagen, T. L. Addition of low-dose tumor necrosis factor-alpha to systemic treatment with STEALTH liposomal doxorubicin (Doxil) improved anti-tumor activity in osteosarcoma-bearing rats. Anticancer Drugs. 16 (6), 667-674 (2005).
- Gabizon, A. A., Lyass, O., Berry, G. J., Wildgust, M. Cardiac safety of pegylated liposomal doxorubicin (Doxil/Caelyx) demonstrated by endomyocardial biopsy in patients with advanced malignancies. Cancer Invest. 22 (5), 663-669 (2004).
- Muggia, F. M. Liposomal encapsulated anthracyclines: new therapeutic horizons. Curr Oncol Rep. 3 (2), 156-162 (2001).
- Li, L., et al. Triggered content release from optimized stealth thermosensitive liposomes using mild hyperthermia. J Control Release. 143 (2), 274-279 (2010).
- Lu, T., Lokerse, W. J., Seynhaeve, A. L., Koning, G. A., ten Hagen, T. L. Formulation and optimization of idarubicin thermosensitive liposomes provides ultrafast triggered release at mild hyperthermia and improves tumor response. J Control Release. 220, 425-437 (2015).
- Seynhaeve, A. L., Dicheva, B. M., Hoving, S., Koning, G. A., Ten Hagen, T. L. Intact Doxil is taken up intracellularly and released doxorubicin sequesters in the lysosome: Evaluated by in vitro/in vivo live cell imaging. J Control Release. 172 (1), 330-340 (2013).
- Dicheva, B. M., et al. Cationic Thermosensitive Liposomes: A Novel Dual Targeted Heat-Triggered Drug Delivery Approach for Endothelial and Tumor Cells. Nano Lett. 13 (6), 2324-2331 (2012).
- Brouckaert, P. G., Leroux-Roels, G. G., Guisez, Y., Tavernier, J., Fiers, W. In vivo anti-tumour activity of recombinant human and murine TNF, alone and in combination with murine IFN-gamma, on a syngeneic murine melanoma. Int J Cancer. 38 (5), 763-769 (1986).
- Van Muijen, G. N., et al. Antigen expression of metastasizing and non-metastasizing human melanoma cells xenografted into nude mice. Clin Exp Metastasis. 9 (3), 259-272 (1991).
- Das, A. M., et al. Differential TIMP3 expression affects tumor progression and angiogenesis in melanomas through regulation of directionally persistent endothelial cell migration. Angiogenesis. 17 (1), 163-177 (2013).
- Brouckaert, P., et al. Tumor necrosis factor-alpha augmented tumor response in B16BL6 melanoma-bearing mice treated with stealth liposomal doxorubicin (Doxil) correlates with altered Doxil pharmacokinetics. Int J Cancer. 109 (3), 442-448 (2004).
- Chen, V. Y., Posada, M. M., Zhao, L., Rosania, G. R. Rapid doxorubicin efflux from the nucleus of drug-resistant cancer cells following extracellular drug clearance. Pharm Res. 24 (11), 2156-2167 (2007).
- Parslow, A., Cardona, A., Bryson-Richardson, R. J. Sample drift correction following 4D confocal time-lapse imaging. J Vis Exp. (86), (2014).
- Li, L., et al. Mild hyperthermia triggered doxorubicin release from optimized stealth thermosensitive liposomes improves intratumoral drug delivery and efficacy. J Control Release. 168 (2), 142-150 (2013).
- Pedrosa, L. R., et al. Improving intracellular Doxorubicin delivery through nanoliposomes equipped with selective tumor cell membrane permeabilizing short-chain sphingolipids. Pharm Res. 30 (7), 1883-1895 (2013).
- Pedrosa, L. R., et al. Short-chain glycoceramides promote intracellular mitoxantrone delivery from novel nanoliposomes into breast cancer cells. Pharm Res. 32 (4), 1354-1367 (2015).
