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医学

À l’aide de In Vitro imagerie de cellules vivantes pour explorer les agents chimiothérapeutiques livré par nanoparticules à base de lipides

Published: November 01, 2017
doi:
10.3791/55405
,
1Laboratory Experimental Surgical Oncology, Section Surgical Oncology, Department of Surgery,Erasmus MC

Summary

Imagerie de cellules vivantes est un outil puissant pour visualiser les processus dynamiques. L’examen des cellules fixes fournit uniquement des images statiques, qui peuvent conduire à des erreurs d’interprétation et de la confusion au sujet du processus. Cet ouvrage présente une méthode pour étudier l’absorption, la libération de la drogue et localisation intracellulaire des nanoparticules LIPOSOMALES dans les cellules vivantes.

Abstract

Les techniques d’imagerie conventionnelles peuvent fournir des informations détaillées sur les processus cellulaires. Toutefois, cette information est basée sur des images statiques dans un système dynamique dans le cas contraire, et les phases successives sont facilement négligés ou mal interprétés. Imagerie de cellules vivantes et microscopie Time-lapse, dans lesquelles des cellules vivantes peuvent être suivis pour plusieurs heures voire jours de façon plus ou moins continue, sont donc très instructifs. Le protocole décrit ici permet d’enquête sur le sort des nanoparticules chimiothérapeutiques après la livraison de la doxorubicine (dox) dans les cellules vivantes. Dox est un agent intercalant qui doit être libéré de ses nanocarrier pour devenir biologiquement actives. Malgré son enregistrement clinique depuis plus de deux décennies, son absorption, le démontage et la libération du médicament ne sont pas encore pleinement compris. Cet article explore l’hypothèse que les nanoparticules à base de lipides sont absorbés par les cellules tumorales et sont dégradent lentement. Dox libérée est alors transloqué dans le noyau. Pour éviter les artéfacts de la fixation, l’imagerie de cellules vivantes et microscopie Time-lapse, décrit dans cette procédure expérimentale, peuvent être appliqués.

Introduction

La capacité de suivre un processus biologique, comme les interactions cellule-cellule, inter- et transport intracellulaire, absorption de composés cytotoxique et interaction protéine-protéine de molécules uniques dans les cellules vivantes et les tissus, a gagné beaucoup d’intérêt au cours des dernières décennie, car il fournit la dimension supplémentaire de « temps réel ». Dans ce manuscrit, une méthode à suivre le destin intracellulaire de dox libre et dox incorporés dans des nanoparticules (Dox-NP) est décrite.

NANOPARTICULES ont été utilisés pendant des décennies pour traiter certains cancers. Dox-NP a été approuvé pour le traitement du sarcome de Kaposi liées au sida, advanced ovarien et du sein cancer et myélome multiple1. Il fut l’un des premiers nanoparticules LIPOSOMALES inventée en milieu clinique. La forme libre, dox, est largement éliminée de la circulation sanguine, limitant sa capacité à atteindre le site de la tumeur en quantité suffisante. En outre, traitement s’accompagne de sévères et limitant la dose-effets secondaires, tels que stomatite et insuffisance cardiaque. Lorsque encapsulés dans des nanoparticules de liposomes pégylés le temps de circulation augmente de minutes à jours2. Ce type de contenant du cholestérol liposome est assez stable et cette stabilité détermine la pharmacocinétique des médicaments encapsulés.

Toutefois, cette rigidité a un revers. La capacité cytotoxique d’un composé vers des cellules tumorales est premier évalué in vitro, et il a été démontré que dox est plus puissant que le Dox-NP en cytotoxiques dosages3,4. Il a été émis l’hypothèse que la stabilité du support empêche la libération et l’assimilation de la drogue, et il est intéressant d’étudier ce phénomène plus loin. Les propriétés intrinsèques LIPOSOMALES, construites pour durer les éléments agressifs dans la circulation sanguine et rejoindre le site de la tumeur intact, a entraîné la biodisponibilité réduite de la composante cytotoxique (c.-à-d., dox) sur le site cible (c’est-à-dire, la tumeur noyau de la cellule). Dox-NP améliorée hardiment la réponse par rapport à la forme libre, il était encore de valeur clinique, comme l’encapsulation a réduit significativement le d’effets cardiotoxiques5. Dans les années suivantes, les autres composés étaient encapsulés dans les nano-transporteurs6. En outre, modifier les transporteurs a abouti à la libération du médicament déclenchée (c.-à-d., sur le site de la tumeur) mais maintenu la stabilité dans le sang circulation7,8. Malgré des années d’enquête et utilisation clinique, les Parques intratumorale du nanocarriers comme Dox-NP ne sont toujours pas entièrement claires. Dans une publication récente, il a été démontré que la nanoparticule est abordée dans son ensemble tandis que le dox reste pris au piège dans les lysosomes9.

Assimilation d’un communiqué de nanoparticules et de la drogue sont des processus dynamiques qui peuvent mieux être surveillés en utilisant l’imagerie de cellules vivantes. En outre, histologie classique, dans lequel les cellules sont incubées et fixe par la suite, peut donner des résultats erronés si la fixation détruit le transporteur liposomal et introduit des artefacts. La condition primordiale pour l’imagerie de cellules vivantes est la visualisation, de préférence par fluorescence, du processus souhaité. Certains composés, comme dox, présentent une fluorescence rouge intrinsèque. En outre, marqueurs fluorescents peuvent être introduits dans le transporteur et organites cellulaires peuvent être visualisées à l’aide de marqueurs de cellules vivantes. De cette façon, un tableau de paramètres, comme l’absorption de la porte-libération du médicament et localisation cellulaire du transporteur et de drogues, peut être imagé et analysé. Ici, on décrit une méthode dans laquelle le sort intercellulaire de dox et Dox-NP dans plusieurs cellules tumorales est suivi en temps réel. En outre, cette méthode peut être facilement adaptée pour créer les conditions idéales pour ciblés (p. ex., chargé des nanoparticules10) et déclenche la libération de médicament (p. ex., hyperthermie7).

Protocol

1. préparation assembler la chambre d’imagerie, qui se compose de deux parties. Placer un verre de couverture de 25 mm ( Figure 1 a -1) dans la partie inférieure de la chambre ( Figure 1 a -2) et vissez la partie supérieure sur la partie inférieure ( Figure 1 a -3). Ne pas serrer trop fort, car le verre peut casser. Autoclave la chambre entière ( Figure 1 a -4). Préparer un milieu de culture cellulaire en complétant Dulbecco ' s Modified Eagle ' s moyen (DMEM) sans rouge de phénol avec 10 % de sérum de veau foetal inactivés par la chaleur (FCS) et 1 mM de L-glutamine dans des conditions stériles. Conserver à 4 ° C et chaud à 37 ° C avant utilisation. Maintenir les cellules avec un milieu de culture cellulaire en cultivant des flacons à l’aide de techniques de culture cellulaire standard. NOTE : Ici, deux lignées de cellules de souris, mélanome B16BL6 11 et Lewis poumon carcinome (LLC) et deux mélanomes humaines, BLM et 1F6 12, ont été utilisées. Make 0,1 % gélatine en pesant et dissoudre la gélatine dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 37 ° C durant la nuit. Stériliser la solution en le filtrant à travers un filtre de 0,22 µm et conserver à 4 ° C. 2. Plaque de cellules retirer la chambre d’imagerie du sachet de stérilisation dans une enceinte à flux laminaire, soigneusement serrer la chambre et le placer dans une boîte de Pétri. Remarque : Pour éviter toute contamination, garder la chambre d’imagerie dans un plat de Pétri jusqu’à ce que la chambre peut être placée sous le microscope. Manteau la vitre de la chambre d’imagerie avec 1 mL de 0,1 % de gélatine stérile pendant 20 min à 37 ° C et 5 % de CO 2. NOTE : Ce qui permettra la meilleure fixation des cellules. Supprimer le moyen des flacons de culture cellulaire (voir étapes 1.2 et 1.3), laver une fois avec du PBS 1 x et détacher les cellules à l’aide de 0,25 % de trypsine. Inactiver la trypsine en ajoutant le milieu de culture cellulaire, recueillir les cellules, les tourner vers le bas à 1 100 x g pendant 5 min et Resuspendre le culot dans 5 mL de milieu de culture cellulaire. Diluer 20 µL de suspension cellulaire avec 20 µL du bleu trypan (qui sera repris par les cellules mortes). Compter le nombre de cellules mortes et vivantes, à l’aide d’un hémocytomètre ; le nombre de cellules mortes ne doit pas dépasser 10 %. Aspirer la gélatine et blanc sur plaque de cellules dans une dilution qui autorise un maximum de 70 % de couverture dans les 24h. Par exemple, utiliser une dilution de 5 x 10, 4 ou 10 x 10 4 cellules dans 1 mL. Permettre aux cellules d’adhérer à 5 % de CO 2 et 37 ° C pendant 24 h. 3. Time-lapse microscopie ( Figure 2) Remarque : ici, un microscope confocal avec un support de scène sur mesure a été utilisé, bien que fabrique la plupart offre une gamme d’incubateurs pour vivre-cellule d’imagerie qui est convient également enquêter sur les medicaments nanomatériaux. Évaluer les cellules au microscope pour confluence, la morphologie cellulaire et la contamination. Replacez la chambre dans l’incubateur à CO 2. Remarque : La confluence ne doit pas dépasser 70 %. Si la morphologie cellulaire est incompatible (c.-à-d., les cellules n’adhèrent pas) ou contamination est détectée, jetez la chambre imagerie. Allumer le microscope confocal ( Figure 1E -1), lumière fluorescente ( Figure 1E -2) et l’ordinateur ( Figure 1E -3). Branchez le radiateur de la lentille de l’objectif et réglez-le à 35 ° C ( Figure 1E -4 + Inser). Préparer l’unité de l’incubation, comme illustré dans la Figure 1 b. Remarque : Cet appareil compose d’une platine chauffante ( Figure 1 b -1), une étape de flux avec un connecteur pour les CO 2 tubes ( Figure 1 b -2) et le CO 2 sonde ( Figure 1 b -3) et une tache rouge de fermeture ( Figure 1 b -4). Ce patch sert à fermer temporairement l’appareil jusqu’à ce que la chambre d’imagerie est placée. Placer l’appareil d’incubation sur la platine du microscope et branchez les dans – et out – débordement CO 2 tubes ( Figure 1E -5). Ouvrez la soupape principale de 2 CO ( Figure 1E -6) et basculez sur le contrôleur de CO 2 ( Figure 1E -7). Vérifiez que la commande est réglée à 5 % de CO 2. Remarque : Pour l’humidité, CO 2 traverse un humidificateur ( Figure 1E -8). Pour des expériences de l’hypoxie, un régulateur séparé de 2 O ( Figure 1E -9) est inclus dans le programme d’installation. Régler la température de l’étape à 37 ° C ( Figure 1E -10). Pour des expériences de l’hyperthermie, régler la température à 42 ° C. autoriser l’unité d’incubation pour atteindre la température sélectionnée et le CO 2 pourcentage. Prendre la chambre d’imagerie de la CO principale incubateur 2 et transporter la chambre dans une boîte de Pétri à la salle de microscopie. Place la chambre d’imagerie ( Figure 1 a -4) en fait à l’ordre, 35 mm de diamètre ( Figure 1 a -5) le titulaire de la scène et fermer la chambre avec un couvercle d’étanchéité sur mesure ( Figure 1 a -6). Remarque : Le couvercle permet de CO 2 passer et empêche l’évaporation et la contamination. Ouvrir l’unité de l’incubation, de remplacer le patch rouge avec la chambre d’imagerie et fermer l’appareil ( Figure 1). Cela aussi vite que possible afin d’éviter le refroidissement des cellules. Assurez-vous qu’aucun câble n’est coincés entre la phase et le microscope. Quitter l’unité pour s’acclimater pendant 30 min. Ouvrez le logiciel et basculez sur les lasers. NOTE : Ici, 488 nm argon, 543 nm hélium-néon et lasers à hélium-néon de 633 nm ont été utilisées. Faire une nouvelle base de données en cliquant sur " New " sous l’onglet fichier nom et enregistrer la base de données. Définir la configuration en cliquant sur " Config " sous l’onglet Acquire Select " mode de " et " voie unique " d’évaluer un fluorophore seul ou " Multi piste " pour plusieurs fluorophores. Sélectionnez les filtres passe-bande approprié correspondant le fluorophore (p. ex., 560 à 615 nm-filtre passe-bande pour dox et Dox-NP ; voir les résultats de représentant pour plus d’exemples). Sélectionnez le canal lumineux-zone dans l’une des pistes. Régler le scan en cliquant sur " Scan " sous l’onglet Acquire ensemble la taille de l’image (1 024 x 1 024), vitesse de numérisation (optimale), scan direction (8-bit, single) et scan moyenne (4) en cliquant sur " Mode. " définir le sténopé (200 µm), de gagner et de compenser () par exemple, 580, 700 et 835 ; Voir Figure 3) et la puissance du laser (488 = 10 %, 543 = 100 %, 633 = 100 %) en cliquant sur " Channels. " enregistrer ces paramètres en cliquant sur " Config " dans la Configuration de l’onglet et les enregistrer dans la base de données de configuration. Définir le Time-lapse en cliquant sur " Multi temps X " ( Figure 1) dans l’onglet Macro " simple emplacement ". Pour maintenir les cellules en bref, sélectionnez la mise au point automatique dans la macro en cliquant sur " Auto Focus. " Remarque : Autofocus est obtenue avec le laser de 633 nm à l’aide de la réflexion du verre comme point de référence. S’appliquent à la configuration sauvegardée en cliquant " voie unique " ou " Multi piste, " de défilement à la configuration requise dans la base de données de configuration, définir l’intervalle de temps (par exemple, 15 min), nombre d’analyses (par exemple, 97) et en cliquant sur " Load Config. " Remarque : l’utilisation de ces paramètres, une série chronologique de 97 x 15 min = 24 h se fera. Nom du Time-lapse dans le " nom de fichier de Base de ", puis sélectionnez la base de données (effectuée à l’étape 3.11) en cliquant sur " Base de données d’Image " pour sauver le Time-lapse. Définir un dossier temporaire en cliquant sur " Image de Tmp dossier. " Remarque : si le système s’arrête ou se bloque pour une raison quelconque, les images sont trouvent dans ce dossier. Ouvrir l’appareil en incubation, soulevez la bague d’imagerie, mettre une goute d’huile à immersion dans l’objectif et fermer l’appareil aussi vite que possible. Se concentrer et de choisir la position dans la salle d’imagerie. Remarque : Cette position contient des cellules dans une monocouche, avec un minimum de 70 % de confluence, permettant l’imagerie de cellules individuelles. Vérifier les paramètres de configuration pour le fond et corriger si nécessaire. NOTE : Le fond peut être corrigé en réduisant la puissance de gain ou de laser. Tout changement dans la configuration doit être enregistrée (voir étape 3.17) et chargés (voir étape 3.18) à nouveau dans la macro. Dans le flux laminaire, diluer le médicament libre ou des nanoparticules à une concentration de 5 µg/mL drogue ou 0,05 µmol de lipides dans le milieu de culture cellulaire. Filtrer sur un filtre de seringue de 0,22 µm si les médicament/nanoparticules ne sont pas stériles. Ouvrir la chambre d’incubation, soulever le couvercle d’étanchéité, retirer le support des cellules, ajouter 1 mL de drogue/nanoparticules dilués et fermer l’appareil aussi vite que possible. Se concentrer sur les cellules et le Time-lapse de départ en cliquant sur " heure de début " dans la macro de Multi temps X. Vérifier régulièrement pour voir si les cellules sont encore en discussion, ou utilisent l’autofocus (voir étape 3.16). Le programme enregistre automatiquement le Time-lapse dans la base de données ; ne fermez pas la base de données pendant l’exécution du programme. 4. Analyse des données selon la question de recherche original, utiliser des logiciels tels que ImageJ pour l’analyse des données (voir la section résultats pour exemples).

Representative Results

Marquage des transporteurs LIPOSOMALES avec différents marqueurs a été précédemment décrit9. Transporteurs étiquetés avec perchlorate de tetramethylindotricarbocyanine dioctadecyl rouge sombre (l’a fait ; Ex = 644 nm ; Em = 665 nm) ou vert 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein) (CF-PE ; Ex = 490 nm ; Em = 515 nm) sont présentés dans ce manuscrit. Pour afficher intercellulaires similitudes et différences dans l’absorption liposomale, libération et localisation intracellulaire, plusieurs types de tumeurs ont été étudiés. Il s’agit de deux lignées de souris, le mélanome de B16BL611 et le carcinome pulmonaire de Lewis (LLC) et deux mélanomes humaines, un fortement métastatique (BLM) et un non métastatiques (1F6) mélanome12,13. Toutes les expériences ont été effectuées à l’aide de cellules vivantes. Dans toutes les expériences, une concentration de 5 µg/mL dox, 5 µg/mL Dox-NP ou 0,05 µmol de nanoparticules ont été administrés pour 3 ou 24 h. mesuré et analysé dox (sous forme libre, libéré, encapsulé, séquestré ou intercalé) ont été dénommés DXR. Un 40 X (ouverture numérique : 1.3) objectif d’huile a été utilisée, et l’imagerie a été réalisée avec un laser à argon 488 nm (puissance de 10 % / 0,2 mW) et un filtre passe-bande de 505 à 550 nm pour CF-PE et marqueur lysosomial (LM)-vert. Un laser à hélium-néon 543 nm (100 % / puissance de 0.2 mW) et un filtre passe-bande de 560 à 615 nm a été utilisé pour dox Dox-NP et rouge-marqueur lysosomal. Un laser hélium-néon de 633 nm (puissance 100 % / 0,5 mW) et un filtre de long passage 640 nm a été utilisé pour. Étant donné son encapsulation, le in vitro de cytotoxicité, biodisponibilité, pharmacocinétique de dox ont été sensiblement modifié3,9,14. La différence entre la biodisponibilité du médicament lorsqu’il est administré sous forme libre et encapsulé est illustrée dans la Figure 3. Dox est un agent intercalant et doit entrer dans le noyau de la cellule de devenir cytotoxiques. Figure 3 et les films 1 et 2 montrent un 3 h en Time-lapse de BLM cellules traitées par dox ou Dox-NP dans des conditions identiques. Quelques minutes d’exposition dox, DXR nucléaire peut être observé (Figure 3 a, 1 film) et, à l’aide d’une faible gain (insert), peut être vu en intercalant dans le noyau. En revanche, lorsqu’il est exposé à Dox-NP, DXR intracellulaire est à peine visible dans ce délai (Figure 3 b, le film 2). Seulement en augmentant le gain de photomultiplicateur, DXR dans le cytoplasme peut être observée (insérer). À l’aide de ImageJ, la densité de pixel de DXR cytoplasmique et nucléaire ont été analysée. Comme les cellules sont en mouvement pendant l’évaluation accélérée, il est important de combiner fluorescente avec des images lumineuses-champ. Cela pose la possibilité des cellules individuelles de suivi et de stabiliser la XY-dérive à l’aide de plugins spécifiques dans ImageJ. Dans l’analyse présentée à la Figure 3, l’image de lumineux-zone a été utilisé pour dessiner une région d’intérêt (ROI) dans le cytoplasme (trait plein) et le noyau (en pointillé). Le gestionnaire de ROI dans ImageJ se trouvent dans le menu analyser > outils > gestionnaire de ROI. Ces ROIs sont utilisées dans l’image fluorescente pour analyser la densité de pixels à l’aide de l’élément de menu analyser > mesure. La différence entre la densité de pixels dans le noyau (Figure 3) et le cytoplasme (Figure 3D) des cellules dox Dox-NP-traités ou confirme ce qu’on voit dans les images. En outre, les cellules ont été incubées pendant 24 h avec dox ou Dox-NP, après quoi le composé a été remplacé par le milieu et immédiatement photographié avec une sensibilité accrue du photomultiplicateur gain (Figure 4). Autres paramètres, tels que la puissance du laser, offset, sténopé et affichage d’image, étaient identiques. Le faible signal DXR dans les cellules par rapport aux traités dox Dox-NP-traitées est frappante. À l’aide d’un gain de 700, DXR dans les cellules traitées Dox-NP devient visible, alors que l’image de dox est déjà surexposée. Cette expérience simple en vitro visualise une différence significative de la biodisponibilité du libre par rapport aux médicaments encapsulés. Lorsque les cellules sont constamment exposés à Dox-NP pendant 24 h, DXR accumule au fil du temps, comme illustré dans la Figure 5 a et films 3 et 4. Le signal augmente dans le cytoplasme, et plus tard, DXR trouve également intercalé dans le noyau. Ces observations sont confirmées par les graphiques de la densité de pixel (Figure 5 b). La densité de pixels cytoplasmique mesurée est inférieure dans BLM comparée aux cellules 1F6 en raison de la différence de distribution intracellulaire. Considérant que le DXR dans les cellules 1F6 est distribué dans toute la cellule, DXR dans les cellules BLM est plus concentrée dans un organite à proximité du noyau (Figure 5). Par conséquent, la localisation du médicament et du transporteur dans différentes lignées cellulaires (Figure 6) a été étudiée. Les cellules ont été incubées pendant 24h avec Dox-NP / n’et imagés. En utilisant l’image de lumineux-zone, une superposition de la membrane cellulaire (trait plein) et le noyau (ligne pointillée) a été dessinée à l’image fluorescente de trois lignées cellulaires différentes. On démontre ici que le transporteur, étiqueté avec, suit le même schéma cytoplasmique comme DXR : concentrée dans un organite à proximité du noyau au BLM, autour du noyau entier dans la LLC et disséminés au hasard dans le cytoplasme de cellules B16BL6. Dans le noyau, seul DXR et non peut être vu, indiquant sorti dox. En réduisant le gain de photomultiplicateur, des vésicules cellulaires individuels contenant DXR et carrier, portant l’a fait, ainsi qu’avec CF-PE (Figures 6 b et 6C), peuvent être vu. DXR cytoplasmique séquestre en petites vésicules, et les cellules sont marquées avec un marqueur lysosomal de cellules vivantes en vert ou en rouge. Le mouvement de ces lysosomes peut être suivi dans les cellules (film 5). DXR cytoplasmique et le nanocarrier sont colocalisées au sein de ces structures, et la différence intercellulaire dans le modèle DXR, comme on le voit dans la Figure 6, est expliquée ici. Les lysosomes sont distribuées au hasard dans tout le cytoplasme dans B16BL6 et sont trouvent à proximité du noyau dans les cellules BLM (Figure 7 a). ImageJ, la colocalisation entre DXR et transporteur dans le lysosome a été calculée (Figure 7 b). Les images en couleurs ont été faites en binaires (processus > binaire > faire binaire) et, en utilisant la plug-in de colocalisation (Analyze > colocalisation), une image de la colocalisation a été faite de DXR avec. Cela crée une image de couleur vert / rouge / blanc, avec des pixels blancs qui représentent les pixels colocalized des deux images. Via le menu point processus > binaire > faire des binaires, les pixels blancs seront séparés et converties en pixels noirs, d’où la densité de pixels est mesurée (Analyze > mesure). Par la suite, une image de la colocalisation a été faite entre cette DXR-a fait l’image et l’image binaire du marqueur lysosomial (LM) et la densité de pixel mesurée. Les données de colocalisation sont le pourcentage de pixels positifs pour DXR-et DXR-/ lysosomal marqueur (Figure 7). Que le transporteur, étiqueté avec CF-PE aussi bien comme l’a fait, se trouve dans le lysosome est également illustré dans la Figure 7. Figure 1 : Instruments et installation d’équipement. A) chambre + nécessités d’imagerie. 25 mm #1 couvercle en verre (1), la partie inférieure de la chambre (2), partie supérieure de la chambre (lieud à l’envers vers le bas) et joint torique (3), titulaire de la scène (4) et étanchéité couvercle (5). Echelle : 2 cm. B) unité d’Incubation. Platine du microscope chauffée (1), stade flux avec en – et out – débordement de CO2 (2), une sonde de2 CO (3) et un patch de clôture (4). Echelle : 2 cm. C) imagerie chambre dans l’unité de l’incubateur, comme vu au microscope. D) macro série plusieurs fois. E) équipement d’imagerie. Inversé microscope (1), lumière fluorescente (2), informatique (3), radiateur (encart 4) de la bague et contrôleur (4, personnage principal), tube flux de CO2 (5), CO2 soupape (6), contrôleur de CO2 (7), CO2 humidificateur (8), O vanne2 et contrôleur (9) et contrôleur de température de scène (10). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 2: schématique des paramètres détaillés dans le protocole 3 de l’article microscope. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 3 : enquête sur la capture à court terme de dox et Dox-NP.  Cellules BLM sont continuellement exposés à dox ou Dox-NP pendant 3 h, et un Time-lapse a été prise. (A) des images fixes de la Time-lapse de cellules incubées avec dox. (B) des images fixes de la Time-lapse de cellules incubées avec Dox-NP. Echelle = 50 µm. (C) Pixel densité augmentation du nucléaire DXR dox Dox-NP-traités et cellules. (D) augmentation de la densité de Pixel de DXR cytoplasmique dans les cellules dox Dox-NP-traités et. Les données représentent la moyenne ± écart-type de 3 cellules par champ. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 4 : enquête sur l’absorption à long terme de dox et Dox-NP dans différentes lignées cellulaires. Les cellules ont été exposées à dox ou Dox-NP et imagés 24h plus tard. Des images ont été prises immédiatement après l’élimination des médicaments, avec 3 différents gains. Echelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 5 : enquête sur l’absorption cellulaire et la dissémination d’agents LIPOSOMALES. Les cellules ont été continuellement exposés à Dox-NP pendant 24 h, et un Time-lapse a été effectuée. (A) des images fixes de la Time-lapse. Echelle = 50 µm. (B) Pixel densité augmentation de DXR dans le noyau et le cytoplasme. Les données représentent la moyenne ± écart-type de 3 cellules par champ. (C) des Images montrant la localisation de DXR au sein de la cellule. Ligne continue : membrane de la cellule, la ligne pointillée : noyau. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 6 : enquête sur la localisation de la drogue et le transporteur dans différentes lignées cellulaires. (A) les cellules ont été exposées à Dox-NP/avez-vous pendant 24 h et imagés. Echelle = 50 µm. (B) les cellules ont été exposés à Dox-NP/a fait/CF-PE pendant 24 h puis photographiés avec un gain d’intensité inférieur à distinguer des vésicules. (C) Bright-champ et DXR overlay montrant DXR dans des vésicules cytoplasmiques (flèche). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Figure 7 : étude de la localisation intracellulaire de la drogue et le transporteur. Cellules sont exposées à Dox-NP / n’ou CF-PE/avez-vous pendant 24 h, et les lysosomes sont visualisées à l’aide du marqueur de lysosomal de cellules vivantes (LM) en vert ou en rouge. (A) la localisation intracellulaire de DXR et du transporteur (DiD). Les flèches représentent les 3 exemples de DXR et fait localisées dans le lysosome. Echelle = 50 µm (B) co-localisation analyse de DXR et le transporteur (DiD) dans les lysosomes (LM) à l’aide de ImageJ. (C) pourcentage de co-localisation de DXR et du transporteur dans les lysosomes. Les données représentent la moyenne ± SEM de 3 expériences individuelles. (D) lysosomale séquestrant du transporteur visualisées à l’aide de deux différents marqueurs. Echelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. Film 1 : liés à Figure 3 : BLM cellules ont été incubées avec dox pendant 3 h. Time-Lapse : 19 images, avec un intervalle de fréquence d’images de 10 min. : 3 images/seconde. Echelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.) Movie 2 : liés à Figure 3 : BLM cellules ont été incubées avec Dox-NP pendant 3 h. Time-Lapse : 19 images, avec un intervalle de fréquence d’images de 10 min. : 3 images/seconde. Echelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.) Movie 3 : liés à Figure 5 : BLM cellules ont été incubées avec Dox-NP pendant 24 h. Time-Lapse : images de 96, avec un intervalle de fréquence d’images de 15 min. : 8 VPS. Echelle = 50 µm.cible VI » = « _blank » > s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.) Movie 4 : liés à Figure 5 : 1F6 cellules ont été incubées avec Dox-NP pendant 24 h. Time-Lapse : images de 96, avec un intervalle de fréquence d’images de 15 min. : 8 VPS. Echelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.) Film 5 : liés à Figure 7 : Cellules de lysosomes de B16BL6 ont été colorées avec un marqueur de cellules vivantes. Time-Lapse : 10 images, avec un intervalle de 10 s. cadence : 3 images/seconde. Echelle = 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Discussion

Tel qu’observé par le passé, la fixation peut détruire liposomale nanocarriers presque immédiatement et DXR libéré forme ces liposomes détruits encore eu le temps d’entrer dans le noyau, ce qui rend l’interprétation des données très difficile et même trompeuse. Avec quelques ajustements microscopiques, le sort chimiothérapeutique dans les cellules vivantes et les tissus peut être examiné régulièrement pour confirmer ou renverser les observations histologiques. Une étude récente a montré l’absorption, la libération et localisation de DXR dans les cellules traitées avec dox libre et encapsulée à l’aide de cellules vivantes d’imagerie Time-lapse9. Cet ouvrage décrit le montage expérimental plus en détail. En utilisant ce modèle, il est possible de visualiser le transport immédiat de dox au noyau, où il s’accumule en permanence jusqu’à ce que la cellule meurt. En revanche, lorsque Dox-NP est utilisé, que de faibles quantités de dox libéré sont trouvent dans le noyau. Bien que l’exposition provoque l’accumulation continue DXR, le signal fluorescent est beaucoup plus faible chez Dox-NP-contre les cellules traitées dox, indiquant une différence dans la concentration cellulaire et cytotoxicité ultérieure. En outre, en utilisant des marqueurs de cellules vivantes, il a été démontré que, lors de l’exposition des cellules à Dox-NP, DXR et le nanocarrier sont situés dans le lysosome. Cela indique que le liposome complet est repris par la cellule et montre l’implication d’une voie d’endocytose pendant l’absorption de ces nanoparticules. Le DXR dans le noyau est clairement de dox libéré. Cependant, en utilisant cette méthode, le DXR et le transporteur co localiser et semblent être pris au piège dans les lysosomes, c’est toujours pas concluants si cela est encapsulé ou libéré dox. Il est possible que la stabilité intrinsèque de la NANOPARTICULE empêche le détachement dox lorsque localisée dans le lysosome.

Dans ce protocole, imagerie de cellules vivantes est démontrée en utilisant une configuration microscopique spécifique, avec un support de scène sur mesure (le cahier des charges peuvent être fournis sur demande). Cependant, plus des manufactures de microscope confocal offrent une gamme d’incubateurs qui effectuent l’imagerie de cellules vivantes. Préserver les conditions de culture cellulaire (p. ex., température, CO2, pH, humidité et stérilité) est le principal critère de ces incubateurs et nécessite quelques essais préliminaires pour déterminer les conditions appropriées, qui est expliqué plus loin. Programmes d’acquisition automatique des données peuvent également être livrés par la même fabrique. Une option « Multi location » rend possible à l’image de plusieurs postes dans la même chambre, analyse statistique de raffinage. Toutefois, cette option dans la macro mentionnée dans ce manuscrit nécessite des positions fixes de XYZ, par lequel la possibilité de corriger la dérive des Z est perdue. Analyse de la dimension Z peut être inclus dans cette macro et utilise une mise au point d’avion pour l’analyse. Cependant, cette technique nécessite une analyse supplémentaire, augmentant les chances de phototoxicité et blanchiment.

Comme avec toutes les mesures de fluorescence, une surexposition est un problème, surtout lorsque l’on compare deux composés avec une absorption cellulaire différente. L’intensité de la fluorescence n’est pas seulement dépendante du signal intrinsèque du composé, mais aussi le taux d’absorption, la concentration et la durée d’exposition de médicament. Comme illustré à la Figure 3, le contenu DXR nucléaire des cellules traitées dox est déjà visible, alors qu’aucun signal n’est observé dans les cellules traitées Dox-NP. Seulement en augmentant le gain le DXR dans les cellules traitées Dox-NP être visualisé, conduisant à une surexposition dans les cellules traitées dox. En outre, même dans les cellules, Dox-NP est hétérogène, qui peut aboutir à inévitable sous- ou surexposition. Surtout lors d’enquêtes sur la provocation policière la DXR cellulaire, le gain a été significativement réduit pour distinguer les différents organites (Figures 5 b et 5C). Ainsi, les mesures représentées par la densité de pixels doivent être accompagnées de l’images représentatives pour l’interprétation des résultats.

Phototoxicité, blanchiment et un faible rapport signal-bruit sont également des questions importantes en microscopie de fluorescence, et un compromis entre la qualité de l’image et l’acquisition de l’image s’impose. Toutefois, même lorsque la configuration de microscope est optimale, la qualité d’image est également en grande partie déterminée par la qualité des cellules et le composé ajouté. DXR donne un signal fort et, avec les précautions adéquates, blanchiment observe pas, même après de longues périodes (jusqu’à 72 h). Toutefois, la réduction du signal fluorescent peut également être un résultat d’efflux. L’efflux est un important phénomène de résistance de drogue15 et se produit lorsque les cellules pomper de la drogue depuis le site d’action intracellulaire. Une diminution du signal fluorescent au fil du temps peut donc également être un résultat de dox efflux9. En comparant le signal fluorescent d’un endroit non scannée à la fin de l’expérience avec la dernière image de la série Time-lapse fera la démonstration de blanchiment (c.-à-d., le signal sera plus élevé à l’emplacement non scannée) ou l’efflux (c.-à-d., les deux signaux sont identiques). Plusieurs options de correctionnelles (p. ex., arrière-plan, dérive, blanchiment, etc.) sont disponibles dans des programmes comme ImageJ16. Aussi, lorsque l’intensité de fluorescence augmente au fil du temps, les paramètres de configuration peuvent être préalablement évaluées dans une expérience pilote pour minimiser la surexposition à la fin de la Time-lapse (étape 3.21). Alternativement, une salle d’imagerie avec cellules déjà exposés à la drogue pour la période souhaitée peut servir à initialiser les paramètres. Enfin, pour ce type d’analyse, les concentrations toxiques (étape 3.22) doivent être évitées et préétablies à l’aide de bio-essais conventionnels.

Les cellules sont continuellement mis en culture et maintenues dans un milieu sans rouge de phénol. Rouge de phénol émet une fluorescence dans la partie rouge du spectre et peut être observé dans les organites cellulaires, probables lysosomes, présentation de l’information de faux-positifs (étape 1.2). Pour permettre le suivi des cellules individuelles, confluent de la cellule ne doit pas dépasser 70 % (étape 3.1.). La CO2 débit-vitesse (étape 3.5) doit être réglementée dans une expérience de validation lorsque l’équipement est acheté ou après l’entretien. Lorsque la vitesse est trop élevée, moyenne s’évaporera. Quand la vitesse est trop faible, le pH du milieu va augmenter, ce qui peut affecter la croissance des cellules. Car le milieu est sans les changements d’indicateur pH phenol red pH ne peuvent être obtenues et sont donc facilement négligés. Une fois que le flux de CO2 est validé, ces paramètres peuvent être utilisés dans toutes les expériences futures.

Utilisant la méthode décrite ici, le sort des nanoparticules peut facilement être examiné aux microscopes Time-lapse et imagerie de cellules vivantes. Dans cette procédure, les nanoparticules commercialement disponibles ont été utilisés. Toutefois, le sort de thermosensible17,10de liposomes cationiques ; liposomes enrichies à chaîne courte shingolipids18; et nanoparticules encapsuler d’autres drogues8,19 ont été également étudiés de cette manière dans la tumeur et les cellules normales.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les installations de microscopie utilisées font partie de l’Erasmus Optical Imaging Center, et nous tenons à remercier le personnel de l’OCI pour leurs services.

Materials

DMEM (no phenol-red) Sigma D1145 Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS
Trypsin-versene (EDTA) Lonza BE17-161E
Fetal calf serum Sigma F7524 Heat inactivate for 30 min at 55 ºC
L-Glutamin Lonza BE17-605E
Gelatin from bovine skin Sigma G9391 Make a 0,1% solution in PBS, sterile
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma D8537
Stericup 0,22 µm filter – 500 ml  Millipore SCGPU05RE
Trypan-blue Sigma T8154
Cells: Lewis lung carcimoma ATCC CRL-1642
Cells: B16BL6 Dr. P. Brouckaert, Ghent University donated Ref.10
Cells: BLM and 1F6 Dr. van Muijen, University of Nijmegen donated Ref.11
Petri dish Greiner 664160
Doxorubicin Actavis  mentioned as dox in the manuscript
Doxil/Caelyx Janssen-Cilag mentioned as Dox-NP in the manuscript
Syringe filter 0.2 µm VWR international 10462200
Lysotracker-green DND-26 Invitrogen L7526 mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript
Lysotracker-red DND-99 Invitrogen L7528 mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript
Attofluor cell ring Invitrogen A7816
Cover glass 25 mm #1 Thermo scientific CB00250RA1
Stage holder + sealing lid Custom made
ZEISS LSM 510 microscope Zeiss
Software LSM 510 version 3.2 SP2 Zeiss
Image J NIH https://imagej.nih.gov/ij/index.html
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References

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Seynhaeve, A. L., ten Hagen, T. L. Using In Vitro Live-cell Imaging to Explore Chemotherapeutics Delivered by Lipid-based Nanoparticles. J. Vis. Exp. (129), e55405, doi:10.3791/55405 (2017).
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