Bir kullanma Lenfosit Ekstravazasyonunun analizi<em> İn Vitro</em> İnsan Kan-beyin bariyeri Model
Summary
Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.
Abstract
Merkezi sinir sisteminde (CNS) içine Lenfosit ekstravazasyon immün gözetim için kritiktir. lenfosit ekstravazasyon hastalığa ilgili değişiklikler CNS'de patofizyolojik değişikliklere neden olabilir. Böylece, CNS içine lenfosit göç soruşturma inflamatuar CNS hastalıkları anlamak ve yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek önemlidir. Burada lenfosit ekstravazasyonu çalışma insan kan-beyin engelinin bir in vitro model sunmaktadır. İnsan beyni mikrovasküler endotelyal hücreleri (HBMEC) confluently, kan-beyin bariyerinin endotelyumu taklit etmek için eklemek Transwell gözenekli polietilen tereftalat yetiştirilmektedir. Bariyer fonksiyonu zonula occludens immünohistokimya, transendotelyal elektrik direnci (TEER) ölçümleri olarak Evans mavisi nüfuz analizi ile doğrulanır. NK hücrelerini – Bu model, / dim CD56 parlak CD16 gibi nadir lenfosit alt grupları diyapedezin soruşturma sağlar. Furthermcevher, diğer hücrelerin, sitokinler ve kemokinlerin, hastalıkla ilişkili değişiklikler ve lenfosit göç kapasitesine belirgin bir tedavi yönteminin etkinliği incelenebilir. Son olarak, endotel bariyere üzerinde iltihabı etkiler etkisi yanı sıra, farklı tedavi rejimleri analiz edilebilir.
Introduction
dokulara kan lenfosit göçü immün gözetim için çok önemlidir. Özel molekül etkileşimleri sonunda bir dizi ince bağırsak, deri, lenf düğümleri, merkezi sinir sistemi (CNS) ve diğer dokular 1 içine alana özgü ekstravazasyonu sağlamaktadır. Lenfosit göçü değişiklikler yaygın hastalıklar 2 bir dizi patofizyolojisinde rol oynamaktadır. Immün öncelikli CNS'ye Geçiş sıkı bir şekilde düzenlenmiştir ve buna göre bu işlemin değişiklikler ensefalomiyelit 3, neuromyelitis optica, inme ve multipl skleroz (MS) 2, 4, 5, 6, 7 gibi merkezi sinir sistemi ile ilgili hastalıklar dahil olmaktadır. Nedenle, daha iyi hastalık patofizyolojisinin ve araçları geliştirmeye lenfosit ekstravazasyondan incelemek için önemlidir hastalık yükü 8, 9, 10, 11, 12 ıslah.
Lenfositler farklı yollardan CNS içine göç ederler. Kan-beyin bariyeri koroid pleksus içinde ve boyunca, kan-beyin-omurilik sıvısı bariyer subaraknoid boşluk içine postkapiler venüllerde yoluyla damar dışına 1, 13, 14, 15 tarif edilmiştir. Kan-beyin bariyeri boyunca geçiş endotel hücreleri 14 lenfositlerin etkileşimi ile yürütülür. periferde endotelyal hücrelere aksine, merkezi sinir sisteminin endotel hücreleri, böylece sıkı bir kan-beyin bariyerini geçme kabiliyetine sahip olan hücreleri ve protein miktarının sınırlandırılması, sıkı bağlantı moleküllerinin yüksek miktarda ekspreselass = "xref"> 16. sıkı bağlantıları gevşemesine iltihabı sonuçları ve yapışma moleküllerinin ifadesini indükler; Bu şekilde, merkezi sinir sistemi 1, 17, 18 içine lenfosit göçünü artar.
Kan-beyin bariyeri üzerinden damar dışına çok aşamalı bir süreçtir. Endotel hücreleri için ipi lenfositler ve daha sonra esas olarak selektinler 1, 15 kaynaklı bir işlemde endotel boyunca rulo. Daha sonra, lenfositler üzerinde ifade edilen endotel tarafından salgılanan kemokinlerin ve ilgili kemokin reseptörlerinin arasındaki etkileşimler endotel hücreleri 1 yapışmasını teşvik integrinlerin uyumsal değişiklikleri başlatır. Son olarak, perivasküler boşluğa transmigrating önce kan akışına karşı endotelyal engeli boyunca her iki taramayı lenfositler ya da hemen ve doğrudan doğruya şanzıman durakfirması yapışma 1, 19, 20 bölgesinde igrate. Lenfosit ekstravazasyon Tüm bu olaylar farklı teknikler 21 kullanılarak in vitro analiz edilebilir. Zaman atlamalı video mikroskopi başlangıç tethering'i ve 15 haddeleme incelemek için kullanılır. Adezyon tahliller engelleri 22 endotel firma tutuklama ile ilgili ayrıntılı bilgi sağlar. Burada gösterildiği gibi transmigrasyon tahlilleri, bağışıklık-hücre göçüne 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 analizini sağlar.
In vitro kan beyin bariyeri modelinde insan kullanarak, daha yüksek bir MIGR olduğunu göstermektedir geçenlerde olabilirCD56 parlak CD16 arasında atory kapasitesi / dim – NK hücrelerini CD16 + muadilleri intratekal bölme 21 bu NK hücresi alt-kümesinin bir ağırlığı tarafından yansıyan dim bunların CD56 ile karşılaştırıldığında. Böylece, bizim deney düzeneği in vitro durumu taklit etmek uygun görünmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada insan kan-beyin bariyeri üzerinden lenfositlerin tenasüh araştırmak için bir teknik sunar. CNS'ye lenfosit göçü in vitro analizleri, lenfosit ekstravazasyonu, potansiyel hastalıkla ilgili değişiklikler ve yeni terapötik yaklaşımlar temel işlemlerini incelemek için önemlidir.
Kan-beyin bariyeri modelinin çeşitli modifikasyonlar mümkündür. Örneğin, üst bölmeden hücreleri göç-hücre populasyonunun bileşimini incelemek için analiz edilebilir. Bu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 “Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease” (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).
Materials
| PBS | Gibco | 14190-094 | without CaCl2 or MgCl2 |
| Fibronectin 1mg/mL | Sigma | F1141-5MG | from bovine plasma |
| T-25 cell culture flask | Greiner BioOne | 690160 | |
| HBMEC | ScienCell | 1000 | |
| Pelobiotech | PB-H-6023 | ||
| Accutase | Sigma | A6964-100ML | |
| ECM-b | ScienCell | 1001-b | |
| FBS | ScienCell | 1001-b | |
| Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 1001-b | |
| Endothelial cell growth supplement | ScienCell | 1001-b | |
| Transwell | Corning | 3472 | clear, 6.5mm diameter, 3.0µm pore size |
| 96-well flat bottom plate | Corning | 3596 | |
| Evans blue | Sigma | E2129-10G | stock solution: 1 g/50 mL PBS |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50x concentrated |
| Infinite M200Pro | Tecan | ||
| 96-well black flat bottom plate | Greiner BioOne | 675086 | |
| 48-well plate | Corning | 3526 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 61870-010 | |
| Flow Count Fluorospheres | Beckman Coulter | 7547053 | |
| Na-EDTA | Sigma | E5134 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Gallios 10-color flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| Kaluza 1.5a | Beckman Coulter | ||
| TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| IFN-γ | Peprotech | 300-02 | |
| CD3-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 300430 | clone UCHT1 |
| CD56-PC7 | Beckman Coulter | A21692 | clone N901 |
| CD16-A750 | Beckman Coulter | A66330 | clone 3G8 |
| CD4-FITC | Biolegend | 300506 | clone RPA-T4 |
| CD8-A700 | Beckman Coulter | A66332 | clone B9.11 |
References
- Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3 (7), 569-581 (2003).
- Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
- Furtado, G. C., et al. A novel model of demyelinating encephalomyelitis induced by monocytes and dendritic cells. J Immunol. 177 (10), 6871-6879 (2006).
- Ransohoff, R. M. Illuminating neuromyelitis optica pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1001-1002 (2012).
- Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68 (5), 311-323 (2002).
- Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 461-471 (2016).
- Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier, chemokines and multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
- Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Kieseier, B. C., Wiendl, H. Immunotherapeutic approaches in MS: update on pathophysiology and emerging agents or strategies 2006. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 7 (1), 35-63 (2007).
- Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Stuve, O., Kieseier, B., Wiendl, H. Multiple sclerosis therapy: an update on recently finished trials. J Neurol. 254 (11), 1473-1490 (2007).
- Wiendl, H., Hohlfeld, R. Multiple sclerosis therapeutics: unexpected outcomes clouding undisputed successes. Neurology. 72 (11), 1008-1015 (2009).
- Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Breuer, J., Posevitz-Fejfar, A., Wiendl, H. JCV index and L-selectin for natalizumab-associated PML risk stratification. Journal of Neuroimmunology. 275 (1-2), 24 (2014).
- Schwab, N., et al. L-selectin is a possible biomarker for individual PML risk in natalizumab-treated MS patients. Neurology. 81 (10), 865-871 (2013).
- Takeshita, Y., Ransohoff, R. M. Inflammatory cell trafficking across the blood-brain barrier: chemokine regulation and in vitro models. Immunol Rev. 248 (1), 228-239 (2012).
- Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Wiendl, H. Trafficking of lymphocytes into the CNS. Oncotarget. 6 (20), 17863-17864 (2015).
- Schneider-Hohendorf, T., et al. VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells. J Exp Med. 211 (9), 1833-1846 (2014).
- Girard, J. P., Springer, T. A. High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration. Immunol Today. 16 (9), 449-457 (1995).
- Brown, D. A., Sawchenko, P. E. Time course and distribution of inflammatory and neurodegenerative events suggest structural bases for the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Comp Neurol. 502 (2), 236-260 (2007).
- Alvarez, J. I., Cayrol, R., Prat, A. Disruption of central nervous system barriers in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 252-264 (2011).
- Rudolph, H., et al. Postarrest stalling rather than crawling favors CD8+ over CD4+ T-cell migration across the blood-brain barrier under flow in vitro. Eur J Immunol. , (2016).
- Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462 (7269), 94-98 (2009).
- Gross, C. C., et al. Impaired NK-mediated regulation of T-cell activity in multiple sclerosis is reconstituted by IL-2 receptor modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), E2973-E2982 (2016).
- Gross, C. C., Brzostowski, J. A., Liu, D. F., Long, E. O. Tethering of Intercellular Adhesion Molecule on Target Cells Is Required for LFA-1-Dependent NK Cell Adhesion and Granule Polarization. Journal of Immunology. 185 (5), 2918-2926 (2010).
- Grutzke, B., et al. Fingolimod treatment promotes regulatory phenotype and function of B cells. Ann Clin Transl Neurol. 2 (2), 119-130 (2015).
- Gobel, K., et al. Blockade of the kinin receptor B1 protects from autoimmune CNS disease by reducing leukocyte trafficking. J Autoimmun. 36 (2), 106-114 (2011).
- Schneider-Hohendorf, T., et al. Regulatory T cells exhibit enhanced migratory characteristics, a feature impaired in patients with multiple sclerosis. Eur J Immunol. 40 (12), 3581-3590 (2010).
- Huang, Y. H., et al. Specific central nervous system recruitment of HLA-G(+) regulatory T cells in multiple sclerosis. Ann Neurol. 66 (2), 171-183 (2009).
- Dehmel, T., et al. Monomethylfumarate reduces in vitro migration of mononuclear cells. Neurol Sci. 35 (7), 1121-1125 (2014).
- Gastpar, R., et al. The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J Immunol. 172 (2), 972-980 (2004).
- Gastpar, R., et al. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells. Cancer Res. 65 (12), 5238-5247 (2005).
- Vandermeeren, M., Janssens, S., Borgers, M., Geysen, J. Dimethylfumarate is an inhibitor of cytokine-induced E-selectin, VCAM-1, and ICAM-1 expression in human endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 234 (1), 19-23 (1997).
- Rubant, S. A., et al. Dimethylfumarate reduces leukocyte rolling in vivo through modulation of adhesion molecule expression. Journal of Investigative Dermatology. 128 (2), 326-331 (2008).
- Hamann, A., et al. Evidence for an accessory role of LFA-1 in lymphocyte-high endothelium interaction during homing. J Immunol. 140 (3), 693-699 (1988).
- Shamri, R., et al. Lymphocyte arrest requires instantaneous induction of an extended LFA-1 conformation mediated by endothelium-bound chemokines. Nat Immunol. 6 (5), 497-506 (2005).
- Didier, N., et al. Secretion of interleukin-1beta by astrocytes mediates endothelin-1 and tumour necrosis factor-alpha effects on human brain microvascular endothelial cell permeability. J Neurochem. 86 (1), 246-254 (2003).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Sci Rep. 4, 4160 (2014).
- Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain Res. 818 (1), 65-71 (1999).
- Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Curr Drug Metab. 9 (9), 901-910 (2008).
- Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (2), 767-777 (2011).
- Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
- Eugenin, E. A., et al. CCL2/monocyte chemoattractant protein-1 mediates enhanced transmigration of human immunodeficiency virus (HIV)-infected leukocytes across the blood-brain barrier: a potential mechanism of HIV-CNS invasion and NeuroAIDS. J Neurosci. 26 (4), 1098-1106 (2006).
- Ubogu, E. E., Callahan, M. K., Tucky, B. H., Ransohoff, R. M. CCR5 expression on monocytes and T cells: modulation by transmigration across the blood-brain barrier in vitro. Cell Immunol. 243 (1), 19-29 (2006).
- Bennett, J., et al. Blood-brain barrier disruption and enhanced vascular permeability in the multiple sclerosis model EAE. J Neuroimmunol. 229 (1-2), 180-191 (2010).
- Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nat Immunol. 8 (10), 1076-1085 (2007).
- Ando, J., Nomura, H., Kamiya, A. The effect of fluid shear stress on the migration and proliferation of cultured endothelial cells. Microvasc Res. 33 (1), 62-70 (1987).
- Lawrence, M. B., Smith, C. W., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Effect of venous shear stress on CD18-mediated neutrophil adhesion to cultured endothelium. Blood. 75 (1), 227-237 (1990).
- Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In Vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. J Pharm Sci. 104 (9), 2727-2746 (2015).
- Cucullo, L., et al. Development of a humanized in vitro blood-brain barrier model to screen for brain penetration of antiepileptic drugs. Epilepsia. 48 (3), 505-516 (2007).
