를 사용하여 림프구 혈관 외로 유출 분석<em> 체외</em> 인간의 혈액 - 뇌 장벽의 모델
Summary
Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.
Abstract
중추 신경계 (CNS)에 넘쳐 림프구는 면역 감시 중요하다. 림프구의 혈관 외 유출의 질병 관련 변경은 CNS의 병태 생리 학적 변화 될 수 있습니다. 따라서, CNS에 림프구 이동의 조사 염증성 CNS 질환을 이해하고 새로운 치료 방법을 개발하는 것이 중요하다. 여기에서 우리는 림프구의 혈관 외 유출을 연구하는 인간의 혈액 – 뇌 장벽의 체외 모델을 제시한다. 인간 뇌 미세 혈관 내피 세포 (HBMEC)는 confluently 혈액 – 뇌 장벽의 내피를 모방 삽입 트랜스 웰 다공성 폴리에틸렌 테레 프탈레이트 상에 성장된다. 배리어 기능 zonula occludens 면역, transendothelial 전기 저항 (티이)의 측정뿐만 아니라, 에반스 블루 투과 분석에 의해 확인된다. NK 세포를 -이 모델은 / 어두워 CD56 밝은 CD16으로 드문 림프구 아형의 diapedesis의 조사를 할 수 있습니다. Furtherm철광석, 다른 세포, 사이토 카인 및 케모카인, 질병과 관련된 변경, 및 림프구의 이동성에 대한 구별 능력 치료법의 효과를 연구 할 수있다. 마지막으로, 내피 장벽의 염증성 자극의 영향뿐만 아니라, 다른 치료법이 분석 될 수있다.
Introduction
조직에 혈액에서 림프구 마이그레이션은 면역 감시 중요하다. 특정 분자 상호 작용의 시퀀스는 소장, 피부, 림프절, 중추 신경계 (CNS), 및 기타 조직으로 한 부위 특이 적 혈관 외 유출을 보장한다. 림프구 이동에 변화가 넓은 확산 질환이 다수의 병태 생리에 참여하고 있습니다. 면역 특권 CNS로 마이그레이션 단단히 통제 목적에 따라이 프로세스의 변화는 뇌척수염 3, 시신경 척수염, 뇌졸중, 및 다발성 경화증 (MS) 2, 4, 5, 6, 7과 같은 CNS 관련 질환에 관여한다. 따라서 더 나은 질병의 병태 생리를 이해하고 도구를 개발하는 림프구의 혈관 외 유출을 연구하는 것이 중요하다 질병 부담이 8, 9, 10, 11, 12의 간척.
림프구는 별개의 경로를 통해 중추 신경계로 이동한다. 혈액 – 뇌 장벽 맥락총 내의 전역 혈액 – 뇌척수액 장벽을 통해 거미 막밑 공간에 모세관 세정맥을 통한 혈관 외 유출 1, 13, 14, 15가 설명되었다. 뇌 혈관 장벽을 통과 마이그레이션은 내피 세포 (14)와 림프구의 상호 작용에 의해 수행된다. 주변부에서 내피 세포는 대조적으로, CNS의 내피 세포함으로써 엄격 혈액 – 뇌 장벽을 횡단 할 수있는 세포와 단백질의 양을 제한하는 단단한 접합부 분자의 높은 발현 양아가씨 = "외부 참조"> 16. 단단히 접합 염증 완화 결과 및 부착 분자의 발현을 유도한다; 따라서, CNS 1, 17, 18로 림프구 이동을 향상.
혈액 – 뇌 장벽을 통해 혈관 외로 유출 다단계 과정이다. 내피 세포 테더 림프구 다음 주로 셀렉틴 1 (15)에 의해 매개되는 과정에서 내피 굴러. 이어서, 림프구상에서 발현 내피 세포에 의해 분비 케모카인 및 각각의 케모카인 수용체 간의 상호 작용함으로써 내피 세포를 1 밀착성을 촉진 인테그린의 구조적 변화를 유도한다. 마지막으로, 혈관 주위 공간으로 transmigrating 전에 혈액의 흐름에 대한 내피 장벽을 따라 하나 크롤링을 림프구, 즉시 직접 기어 박스 실속확고한 부착 1, 19, 20의 사이트 igrate. 림프구의 혈관 외 유출의 이러한 모든 단계는 별개의 기술 (21)를 사용하여 체외에서 분석 할 수 있습니다. 시간 경과 비디오 현미경은 초기 테 더링 및 15 롤링을 연구하는 데 사용됩니다. 접착 분석은 장벽 (22) 내피 회사 체포에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 여기에서 입증 된 바와 같이 윤회 분석은 면역 세포 윤회 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29의 분석을 허용한다.
체외 혈액 뇌 장벽 모델에서 인간을 사용하여, 우리는 더 높은 마이그레이션 백분율이 보여 최근 수CD56 밝은 CD16의 atory 용량 / 어두워 – NK 세포 CD16 + 대조 물이 막내 실 21이 NK 세포 서브 세트의 우세에 의해 반사 된 희미한들은 CD56에 비해. 따라서, 우리의 실험 장치는 생체 내 상황을 모방하기에 적합한 것 같다.
Protocol
1. 셀 인간의 뇌 미세 혈관 내피 세포의 문화 (HBMEC) 세포 배양 플라스크의 코팅 상기 피브로넥틴 용액을 제조 15 mL의 원심 분리 튜브에 10 ㎖의 PBS를 추가한다. 150 μL의 피브로넥틴을 넣고 잘 섞는다. 바닥을 덮는 T-25 세포 배양 물 플라스크 피브로넥틴 용액 2 mL를 넣고. 배양기에서 37 ℃에서 적어도 3 시간 동안 세포 배양 플라스크를 인큐베이션. 피브로넥틴 코팅 된 플라스크?…
Representative Results
NK 세포 및 인간 혈액 – 뇌 장벽 모델 (도 1A)를 사용하여 T 세포의 서브 세트 윤회를 나타내는 대표적인 결과를 나타낸다. HBMEC 단층의 무결성은 단단히 접합 분자 ZO-1, transendothelial 전기 저항 (티이) 측정 및 에반스 블루 투과 (도 1b)의 염색에 의해 확인 하였다. 다음 3 – 사일 배양 HBMEC가 꽉 접합 분자 ZO-1 (왼쪽 그림 1B 등)를 표시했다. 또?…
Discussion
여기서 우리는 인간의 혈액 – 뇌 장벽에 걸쳐 림프구의 윤회를 조사하기 위해 기술을 제시한다. 중추 신경계에 림프구 이동의 체외 분석에서 림프구의 혈관 외 유출, 잠재적 인 질병 관련 변경 및 새로운 치료 방법의 기본 프로세스를 연구하는 것이 중요하다.
혈액 – 뇌 장벽 모델의 몇 가지 수정이 가능합니다. 예를 들어, 상기 상부 구획으로부터 세포 이주되지 않은 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study has been supported by the Collaborative Research Centre CRC TR128 “Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease” (Project A9 to H.W. and C.C.G., project B1 to N.S.).
Materials
| PBS | Gibco | 14190-094 | without CaCl2 or MgCl2 |
| Fibronectin 1mg/mL | Sigma | F1141-5MG | from bovine plasma |
| T-25 cell culture flask | Greiner BioOne | 690160 | |
| HBMEC | ScienCell | 1000 | |
| Pelobiotech | PB-H-6023 | ||
| Accutase | Sigma | A6964-100ML | |
| ECM-b | ScienCell | 1001-b | |
| FBS | ScienCell | 1001-b | |
| Penicillin/Streptomycin | ScienCell | 1001-b | |
| Endothelial cell growth supplement | ScienCell | 1001-b | |
| Transwell | Corning | 3472 | clear, 6.5mm diameter, 3.0µm pore size |
| 96-well flat bottom plate | Corning | 3596 | |
| Evans blue | Sigma | E2129-10G | stock solution: 1 g/50 mL PBS |
| B27 | Gibco | 17504-044 | 50x concentrated |
| Infinite M200Pro | Tecan | ||
| 96-well black flat bottom plate | Greiner BioOne | 675086 | |
| 48-well plate | Corning | 3526 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 61870-010 | |
| Flow Count Fluorospheres | Beckman Coulter | 7547053 | |
| Na-EDTA | Sigma | E5134 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| Gallios 10-color flow cytometer | Beckman Coulter | ||
| Kaluza 1.5a | Beckman Coulter | ||
| TNF-α | Peprotech | 300-01A | |
| IFN-γ | Peprotech | 300-02 | |
| CD3-PerCP/Cy5.5 | Biolegend | 300430 | clone UCHT1 |
| CD56-PC7 | Beckman Coulter | A21692 | clone N901 |
| CD16-A750 | Beckman Coulter | A66330 | clone 3G8 |
| CD4-FITC | Biolegend | 300506 | clone RPA-T4 |
| CD8-A700 | Beckman Coulter | A66332 | clone B9.11 |
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Cite This Article
Schulte-Mecklenbeck, A., Bhatia, U., Schneider-Hohendorf, T., Schwab, N., Wiendl, H., Gross, C. C. Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier. J. Vis. Exp. (122), e55390, doi:10.3791/55390 (2017).