Maturation des cardiomyocytes dérivés de cellules souches humaines dans la stimulation électrique Biowires utilisant
Summary
La plate – forme BIOWIRE cardiaque est un procédé in vitro utilisé pour arriver à maturité embryonnaire humain et induit des cardiomyocytes dérivés de cellules-souches pluripotentes (HPSC-CM) en combinant la culture de cellules en trois dimensions avec une stimulation électrique. Ce manuscrit présente la configuration détaillée de la plate-forme BIOWIRE cardiaque.
Abstract
Les cardiomyocytes à base de cellules souches pluripotentes humaines (HPSC-CM) ont été une source cellulaire prometteuse et ont donc encouragé la recherche de leurs applications potentielles dans la recherche cardiaque, y compris la découverte de médicaments, la modélisation de la maladie, l'ingénierie tissulaire et la médecine régénératrice. Cependant, les cellules produites par des protocoles existants présentent une gamme d'immaturité par rapport aux cardiomyocytes ventriculaires adultes adultes. De nombreux efforts ont été faits pour maturité des HPSC-CM, avec une maturation modérée atteinte jusqu'ici. Par conséquent, un système d'ingénierie, appelé biowire, a été conçu en fournissant des indices physiques et électriques pour conduire les CMH-CM à un état plus mature in vitro . Le système utilise une plate-forme microfabricée pour semer les hPSC-CM dans le gel de collagène de type I le long d'une suture de modèle rigide pour assembler en tissu cardiaque aligné (biowire), qui est soumis à une stimulation de champ électrique avec une fréquence progressivement croissante. Par rapport aux contrôles non stimulés,stimulées biowired cardiomyocytes présentent un degré accru de maturation structurelle et électrophysiologiques. Ces changements dépendent du taux de stimulation. Ce manuscrit décrit en détail la conception et la création de biowires.
Introduction
la thérapie à base de cellules est l'une des stratégies les plus prometteuses et une enquête pour parvenir à la réparation / régénération cardiaque. Il a été aidé par l' ingénierie tissulaire cardiaque et la co-livraison de 1, 2 biomatériaux. La plupart des sources cellulaires disponibles ont été étudiés dans des modèles animaux pour leurs effets potentiellement bénéfiques sur endommagés, malades ou âgés de 3 coeurs. En particulier, des efforts importants ont été faits pour utiliser les cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) cardiomyocytes (HPSC dérivée de-CM), une source de cellules autologues potentiellement illimitée pour l'ingénierie tissulaire cardiaque. HPSC-CMS peut être produite en utilisant plusieurs protocoles établis 4, 5, 6. Cependant, les cellules obtenues présentent des phénotypes de type foetaux, avec une gamme de caractéristiques immatures par rapport à des cardiomyocytes ventriculaires adultes 7, </sup> 8. Cela peut être un obstacle à l'application de HPSC- en tant que modèles de CMs tissu cardiaque adulte dans la recherche de la découverte de médicaments et dans le développement de modèles de maladies cardiaques adultes 9.
Afin de surmonter cette limitation de l'immaturité phénotypiques, de nouvelles approches ont été étudiées activement pour favoriser la maturation des cardiomyocytes. Les premières études ont révélé des propriétés efficaces pro-maturation dans les cardiomyocytes de rats nouveau – nés par mécanique cyclique 10 ou la stimulation électrique 11. Le compactage du gel et de la stimulation mécanique cyclique ont été montrés également à améliorer certains aspects de la maturation HPSC-CM 12, 13, avec la mise en valeur minimale des propriétés de manipulation et de calcium électrophysiologiques. Par conséquent, un système de plate-forme appelée « fil biologique » (de BIOWIRE) a été conçu en fournissant les deux signaux de structure et champ électrique stimulationn pour améliorer la maturation des HPSC-CM 14. Ce système utilise une plate-forme microfabriqué pour créer un tissu cardiaque alignés qui se prête à une stimulation de champ électrique. Cela peut être utilisé pour améliorer la maturité structurelle et électrophysiologique de HPSC-Cms. Nous décrivons ici les détails de fabrication de ces biowires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce manuscrit décrit l'installation et la mise en œuvre de la plate-forme d'ingénierie, biowire, pour améliorer la maturation des CMH-CM. Le dispositif peut être fabriqué dans des installations de microfabrication standard, et les biowires peuvent être produits avec des techniques communes de culture cellulaire et un stimulateur électrique.
À notre connaissance, il n'y a pas de méthode rapportée semblable à celle de Biowires. Cette stratégie révèle que les propriét…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une subvention de l'État du cœur et la Fondation des maladies du Canada (G-14-0006265), les subventions de fonctionnement des Instituts de recherche en santé (137352 et 143066), et une subvention de la Fondation JP Bickell (1.013.821 ) à SSN.
Materials
| L-Ascorbic acid | Sigma | A-4544 | hPSC-CM culture media componet |
| AutoCAD | Autodesk, Inc | Software to design device | |
| Carbon rods, Ø 3 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Collagen, type 1, rat tail | BD Biosciences | 354249 | Collagen gel: 2.1 mg/ml of rat tail collagen type I in 24.9 mM glucose, 23.8 mM NaHCO3, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, in 1xM199 media with 10 % of growth factor-reduced Matrigel. |
| Collagenase type I | Sigma | C0130 | 0.2% collagenase type I (w/v) and 20% FBS (v/v) in PBS with Ca2+ and Mg2+. Sterilize with 0.22 μm filter and make 12 ml aliquots. Store at -20 °C. |
| Deoxyribonuclease I (DNase I) | EMD Millipore | 260913-25MU | Make 1 mg/ml DNase I stock solution in water. Filter sterile and store 0.5 ml aliquots at −20 °C |
| Drill & drill bits (Ø 1mm and 2 mm) | Dremel | Drill holes in polycarbonate frames | |
| Electrical stimulator | Grass | s88x | |
| Fetal bovine serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-450 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G5767 | Collagen gel component |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| H2O | MilliQ | 18.2 MΩ·cm at 25 °C, ultrapure, to make all solutions | |
| HEPES | Sigma | H4034 | Collagen gel component |
| Hot plate | Torrey Pines | HS40 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium(IMDM) | Thermo Fisher Scientific | 12440053 | |
| Mask aligner | EVG | EVG 620 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 354230 | Collagen gel component |
| Medium 199 (M199) | Thermo Fisher Scientific | 11150059 | Collagen gel component |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma | M-6145 | hPSC-CM culture media componet |
| Orbital shaker | VWR | 89032-088 | |
| Penicillin/Streptomycin (P/S) | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) with Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14040133 | |
| Plate (6-well) | Corning | 353046 | |
| Plate (6-well), low attachment | Corning | 3471 | |
| Platinum wires, 0.2 mm | Electrical stimulator chamber component | ||
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Doe & Ingalls Inc. | To develop the wafer | |
| Pouch, peel-open | Convertors | 92308 | For steam sterilization |
| Silicon wafer, 4-inch | UniversityWafer Inc. | ||
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma | S5761 | Collagen gel component |
| Sodium hydroxide | Sigma | S8045 | Collagen gel component |
| Sprin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| StemPro-34 culture medium | Thermo Fisher Scientific | 10639011 | hPSC-CM culture medium. To make 50 ml, add 1.3 ml supplement, 500 μl of 100× L-Glutamine, 250 μl of 30 mg/ml transferrin, 500 μl of 5 mg/ml ascorbic acid, 150 μl of 26 μl /2 ml monothioglycerol (MTG), and 500 μl (1 %) penicillin/streptomycin. |
| Stop media | Wash medium:FBS (1:1) | ||
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | photoresist, master component | |
| Transferrin | Roche | 10-652-202 | hPSC-CM culture media componet |
| Trypsin/EDTA, 0.25% | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | hPSC-CM culture media componet |
| Wash medium | IMDM containing 1% Penicillin/Streptomycin |
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