Modeling human brain development has been hindered due to the unprecedented complexity of neural epithelial tissue. Here, a method for the robust generation of brain organoids to delineate early events of human brain development and to model microcephaly in vitro is described.
The restricted availability of suitable in vitro models that can reliably represent complex human brain development is a significant bottleneck that limits the translation of basic brain research into clinical application. While induced pluripotent stem cells (iPSCs) have replaced the ethically questionable human embryonic stem cells, iPSC-based neuronal differentiation studies remain descriptive at the cellular level but fail to adequately provide the details that could be derived from a complex, 3D human brain tissue.
This gap is now filled through the application of iPSC-derived, 3D brain organoids, “Brains in a dish,” that model many features of complex human brain development. Here, a method for generating iPSC-derived, 3D brain organoids is described. The organoids can help with modeling autosomal recessive primary microcephaly (MCPH), a rare human neurodevelopmental disorder. A widely accepted explanation for the brain malformation in MCPH is a depletion of the neural stem cell pool during the early stages of human brain development, a developmental defect that is difficult to recreate or prove in vitro.
To study MCPH, we generated iPSCs from patient-derived fibroblasts carrying a mutation in the centrosomal protein CPAP. By analyzing the ventricular zone of microcephaly 3D brain organoids, we showed the premature differentiation of neural progenitors. These 3D brain organoids are a powerful in vitro system that will be instrumental in modeling congenital brain disorders induced by neurotoxic chemicals, neurotrophic viral infections, or inherited genetic mutations.
Humane nevrologiske lidelser, for eksempel microcephaly, kan bare lite studert i dyremodeller på grunn av det faktum at menneskelige hjerne har en utvidet kortikale overflate, en unik funksjon som er forskjellig fra ikke-humane dyr.
Dette aspektet gjør menneskelige hjerne utvikling en kompleks prosess som ikke i tilstrekkelig grad kan studeres i en 2D, in vitro cellekultursystem. Vekst 3D-kulturteknikker muliggjør genereringen av vev-lignende organoids fra induserte pluripotente stamceller (iPSCs). Den in vitro differensiering av pluripotente stamceller i et 3D-suspensjonskultur muliggjør dannelsen av forskjellige celletyper på en riktig og område-spesifikk måte, noe som gir opphav til en organisert, lagdelt vev 1, 2, 3. Takket være laboratorier som var foregangs 3D kulturteknologi og demystified kompleksiteten av organdannelse, ved å starte fra stamcellervi utviklet en robust metode for å generere hjerne organoids å avgrense tidlige hendelser av human utvikling av hjernen og å modellere microcephaly in vitro-1, 2, 3. Det er bemerkelsesverdig at vi tilpasset den opprinnelige metoden utviklet av Lancaster et al. å generere cerebrale organoids 1. Denne metoden ble endret i henhold til våre eksperimentelle krav.
Hensikten med en studie fra Gabriel et al. var å analysere de cellulære og molekylære mekanismer for neurale stamcelle vedlikehold i løpet av utvikling av hjernen. For å gjøre dette, ble en mekanistisk studie utført ved analyse av neurale progenitorceller (NPC) i 3D hjerne organoids avledet fra en pasient microcephaly 4. Denne pasienten båret en mutasjon i CPAP, en konservert centrosomal protein som er nødvendig for sentrosomen biogenese 5. En allment akseptert hypoOppgaven er at microcephaly er et resultat av en utarming av NPC bassenget, og dette kan skyldes enten til celledød, eller til for tidlig differensierings 1, 6, 7, 8, 9.
Ved å analysere de ventrikulære sonene (VZs) av microcephaly hjerne organoids, ble det vist at et betydelig antall av NPC gjennomgå asymmetrisk celledeling, i motsetning til hjernen organoids som stammer fra en frisk donor 4. Omfattende mikroskopiske og biokjemiske analyser av microcephalic hjerne organoids viste en uventet rolle for CPAP i tide cilia demontering 4. Nærmere bestemt er mutert CPAP forbundet med retardert cilium demontering og forsinket cellesyklus reentring, som fører til for tidlig differensiering av NPC-4. Disse resultatene tyder på en rolle for flimmerhårene i microcephaly og thEIR engasjement under nevrogenesen og hjernestørrelse kontroll 10.
Den første delen av denne protokollen er en beskrivelse av en tre-trinns metode for å frembringe homogene hjerne organoids. Som nevnt før, ble den opprinnelige Lancaster protokollen tilpasset og modifisert for å passe vårt formål 1. For det første humane iPSCs dyrkes i et definert mater-fri tilstand på Engelbreth-Holm-sverm (HMS) matrise. Dette trinnet unngår variasjoner av mater-avhengige pluripotent stamcelle-kulturer. I denne protokollen, til induksjon av nevrale differensiering danner neurale epitel starter direkte fra iPSCs. Ved å hoppe over den embryoid legeme (EB) dannelsestrinn, neural differensiering foregår i en mer kontrollert og dirigert måte. Denne fremgangsmåten begrenser den spontane og urettet dannelse av andre kimcelle-lag, så som mesoderm og endoderm. Ved å bruke denne protokollen, kan neurosfærer som inneholder neurale rosetter bli høstet på dag 5 etter EHS matrise innebygging og stasjonær suspensjonskultur. Den organoid medium som anvendes for det tredje trinn i vår protokoll er supplert med dorsomorphin og SB431542. Dorsomorphin er en småmolekyl-inhibitor av benmorfogent protein (BMP), og SB431542 hemmer TGFp / aktivin / nodal signalveien. Kombinasjonen av disse faktorene kan fremme nerve differensiering mer effektivt enn retinsyre alene 11, 12, 13, 14.
Til sammen er disse modifikasjoner muliggjøre reproduserbare generering av hjerne organoids, med minimale variasjoner på tvers av organoids. Viktigere, ble denne metoden anvendt for å generere robuste microcephalic hjerne organoids fra pasient iPSCs, som bærer mutasjoner i gener som påvirker centrosomer og celle-syklus dynamikk.
Den andre delen av denne protokollen gir instruksjoner om å forberede brain organoids for analyse og tolkning av cellulære defekter i microcephaly. Dette inkluderer fiksering, cryosectioning, immuno-fluorescensfarging, og konfokal mikroskopisk analyse. Denne protokollen vil gi leseren en detaljert beskrivelse av forventede resultater, og med veiledning for tolkning.
MCPH er en kompleks human nevrologiske lidelser som ikke kan rekapitulert i dyremodeller in vivo eller i enkle humane cellekultur nærmer seg in vitro. Den kliniske manifestasjon av MCPH begynner å dukke opp i løpet av første trimester, når tidlig neurogenesis begynner. Således, 3D hjernen organoids representerer en pålitelig eksperimentelt system for å modellere MCPH utvikling. I tillegg, 3D human hjerne organoids er en ideell fremgangsmåte fordi i) de gir mulighet for tilpasning av et spekter…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Fritz Thyssen Foundation (Az.10.14.2.152). Vi er takknemlige til vevet embedding anlegget og mikroskop kjernen innretningen av CMMC. Vi er takknemlige for diskusjonene og teknisk støtte fra medlemmer av Laboratorium for sentrosomen og Cytoskjelett biologi. Vi takker Li Ming Gooi for korrekturlesing av manuskriptet.
Anti-mouse 488 | Invitrogen | A-11001 | Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 |
Anti-rabbit 647 | Invitrogen | A-21245 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 |
Arl13b | proteintech | 17711-1-AP | ARL13B rabbit polyclonal antibody |
CELLSPIN system | IBS Integra Bioscience | 183001 | |
DAPI | Sigma-Aldrich, US | 32670 | 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; multiple suppliers |
DMEM/F-12 | Gibco, US | 31331093 | Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 |
Dorsomorphin | Sigma-Aldrich, US | P5499 | Compound C; multiple suppliers |
Embedding medium | AppliChem | A9011, 0100 | Mowiol; embedding medium; multiple suppliers |
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrix | Corning | 354277 | Matrigel hESC-qualified matrix; important: hESC qualified |
Fish gelatin | Sigma-Aldrich, US | G7765-250ML | Gelatin from cold water fish skin; multiple suppliers; autoclave after adding to PBS to dissolve and sterilize, store at 4°C |
Glycine | AppliChem | A1067,1000 | Glycine for molecular biology; multiple suppliers |
Inoculation loop with needle, disposable (1 µl) | Sigma Aldrich, US | BR452201-1000EA | multiple suppliers |
Insulin | Sigma-Aldrich, US | I3536-100MG | multiple suppliers |
L-glutamine | Gibco, US | 25030081 | L-glutamine (200 mM) |
Medium A | Stem cell technologies | #05850 | mTeSR1 (hiPSC medium) |
Medium B | Stem cell technologies | #05835 | Neural induction medium (NIM); neural differentiation medium |
Medium C | Gibco, US | 21103049 | Neural Basal Medium |
MEM | Gibco, US | 11140035 | MEM non-essential amino acids solution (100x) |
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza, Switzerland | #LT07-218 | Mycoplasma detection kit; multiple suppliers |
Nestin | Novus biologicals | NBP1-92717 | Nestin mouse monoclonal antibody (4D11) |
Paraformaldehyde (PFA) | AppliChem | A3813, 0500 | 4% in PBS, store solution at -20°C; caution: wear skin and eye protection and work under hood |
PBS tablets | Gibco, US | 18912014 | See manufacturer´s instructions; multiple suppliers |
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | Gibco, US | 15140122 | Multiple suppliers |
Poly-L-lysine solution (PLL) | Sigma-Aldrich, US | P8920-100ML | Multiple suppliers |
pVim | MBL | D076-3S | Phospho-Vimentin (Ser55) mAb |
Reagent A | Stem cell technologies | # 05872 | Note to Protocol 1.1.1.2; ReLSR (Enzyme-free human ES and iPS cell selection and passaging reagent); please follow manufactorer´s protocol; alternative products from muliple suppliers available |
Reagent B | Sigma-Aldrich, US | A6964-100ML | Accutase solution is an enzymatic solution for single cell dissociation; multiple suppliers; protocol 1.1.2 "enzymatic cell dissociation solution” |
Research Cryostat Leica CM3050 S | Leica biosystems | CM3050 S | Multiple suppliers |
SB431542 | Selleckchem.com | S1067 | Multiple suppliers |
Spinner flask 250 ml | IBS Integra Bioscience | 182026 | |
Sucrose | AppliChem | A4734, 1000 | Multiple suppliers |
Superfrost ultra plus microscope slides | Thermo scientific, US | J3800AMNZ | Slides should be labeled with a "+" and positively charged |
Supplement 1 | Gibco, US | 17502048 | N-2 supplement (100x) |
Supplement 2 w/o Vitamin A | Gibco, US | 12587010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A; multiple suppliers |
Tissue-Tek Cryomold | Sakura, NL | 4565 | Multiple suppliers |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura, NL | 4583 | Multiple suppliers |
Triton X-100 | AppliChem | A1388,0500 | Multiple suppliers multiple suppliers |
TUJ1 | Sigma-Aldrich, US | T2200 | β-Tubulin III (rabbit polyclonal) |
TUNEL assay | Promega, US | G3250 | DeadEnd Fluorometric TUNEL system; multiple suppliers |
Tween 20 for molecular biology | AppliChem | A4974,0500 | Multiple suppliers |
waterproof sheet | BEMIS company, inc. | PM996 | Parafilm “M”; multiple suppliers |
Y-27632 | Selleckchem.com | S1049 | ROCK-inhibitor (Y-27632 2HCL); multiple suppliers |
β-mercaptoethanol | Gibco, US | 31350010 | 2-mercaptoethanol (50 mM); multiple suppliers |