disturbi dello sviluppo neurologico umana, come la microcefalia, possono essere studiate solo male in modelli animali a causa del fatto che il cervello umano ha una superficie corticale estesa, una caratteristica unica diversa da animali non umani.

Questo aspetto rende lo sviluppo del cervello umano un processo complesso che non può essere studiato sufficientemente in 2D, nel sistema di coltura cellulare in vitro. Emergenti tecniche di coltura 3D consentono la generazione di organoidi tessuto simile da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs). La differenziazione in vitro di cellule staminali pluripotenti in coltura in sospensione 3D permette la formazione di vari tipi di cellule in un modo tempestivo e regione specifica, dando origine ad un organizzato, tessuto stratificato ^{1, 2, 3.} Grazie a laboratori che pionieri tecnologie di coltura 3D e demistificato la complessità della formazione degli organi, partendo da cellule staminali,abbiamo sviluppato un metodo robusto di generare organoidi cerebrali delineare eventi precoci di sviluppo del cervello umano e modellare microcefalia in vitro ^{1, 2, 3.} È da notare che abbiamo adattato il metodo originale sviluppato da Lancaster et al. generare organoidi cerebrali ^1. Questo metodo è stato modificato in base alle nostre esigenze sperimentali.

L'obiettivo di uno studio da Gabriel et al. sia per analizzare i meccanismi cellulari e molecolari della neurale mantenimento delle cellule staminali durante lo sviluppo cerebrale. Per fare questo, uno studio meccanicistico è stato effettuato analizzando le cellule progenitrici neurali (NPC) in organoidi cervello 3D derivate da un paziente microcefalia ^4. Questo paziente portava una mutazione in CPAP, una proteina conservata centrosomica richiesto per la biogenesi centrosome ^5. Una crisi ipoglicemica ampiamente accettatatesi è che microcefalia è il risultato di una deplezione del pool NPC, e questo potrebbe essere dovuto sia a morte cellulare o alla differenziazione precoce ^{1, 6, 7, 8, 9.}

Analizzando le zone ventricolari (VZS) di organoidi cerebrali microcefalia, è stato dimostrato che un numero significativo di NPC subisce divisione cellulare asimmetrica, a differenza organoidi cerebrali derivate da un donatore sano ^4. Ampie analisi microscopiche e biochimiche del cervello organoidi microcefalia hanno rivelato un ruolo inaspettato per CPAP in tempo utile lo smontaggio cilia ^4. Specificamente, CPAP mutato è associato ritardato smontaggio cilium e ritardata ciclo cellulare rientro, porta alla differenziazione precoce di NPC ^4. Questi risultati suggeriscono un ruolo per cilia in microcefalia e THcoinvolgimento EIR durante la neurogenesi e le dimensioni del cervello di controllo ^10.

La prima parte di questo protocollo è una descrizione di un metodo in tre fasi per generare organoidi cerebrali omogenei. Come accennato prima, il protocollo Lancaster originale è stato adattato e modificato per soddisfare il nostro scopo ^1. In primo luogo, iPSCs umani sono coltivate in una condizione priva di alimentazione definita sulla matrice Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Questo passaggio evita le variazioni di colture di cellule staminali pluripotenti alimentatore-dipendente. In questo protocollo, l'induzione della differenziazione neurale per formare epitelio neurale parte direttamente dal iPSCs. Saltando la fase di formazione del corpo embrioide (EB), i neurali procede differenziazione in maniera più controllata e diretta. Questo approccio limita la formazione spontanea e non orientato di altri strati di cellule germinali, come mesoderma e endoderma. Applicando questo protocollo, neurosfere contenenti rosette neurali possono essere raccolte il giorno 5 per EHS matrice incorporamento e coltura in sospensione stazionario. Il mezzo organoide utilizzato per il terzo gradino del nostro protocollo è completato con dorsomorphin e SB431542. Dorsomorphin è un inibitore della piccola molecola di proteina morfogenica ossea (BMP), e inibisce la SB431542 / activin / via di segnalazione nodale TGFp. La combinazione di questi fattori potrebbe promuovere la differenziazione neuronale più efficiente rispetto all'acido retinoico solo ^{11, 12, 13, 14.}

Complessivamente, queste modifiche consentono la generazione riproducibile di organoidi cerebrali, con variazioni minime attraverso organoidi. È importante sottolineare che questo metodo è stato applicato per generare robusto organoidi cerebrali microcefalia da iPSCs paziente, che portano le mutazioni nei geni che influiscono centrosomi e dinamiche del ciclo cellulare.

La seconda parte di questo protocollo fornisce le istruzioni per preparare brain organoidi per l'analisi e l'interpretazione dei difetti cellulari in microcefalia. Questo include la fissazione, criosezionamento, colorazione di immunofluorescenza e analisi al microscopio confocale. Questo protocollo fornirà al lettore una descrizione dettagliata dei risultati attesi e con la guida per l'interpretazione.