troubles neurodéveloppementaux humains, tels que microcéphalie, ne peuvent être mal étudiés dans des modèles animaux en raison du fait que les cerveaux humains ont une surface corticale étendue, une caractéristique unique différent des animaux non humains.

Cet aspect rend le développement du cerveau humain un processus complexe qui ne peut pas être suffisamment étudié dans une 2D, système in vitro de culture cellulaire. Nouvelles techniques de culture 3D permettent la génération d'organites analogue à un tissu à partir de cellules souches pluripotentes induites (CISP). La différenciation des cellules souches pluripotentes dans une culture en suspension 3D in vitro permet la formation de différents types de cellules en temps opportun et spécifique à la région, ce qui donne lieu à une organisation, d'un tissu stratifié ^{1, 2, 3.} Merci aux laboratoires qui furent les pionniers des technologies de culture 3D et démystifié la complexité de la formation d'organes, à partir de cellules souches,nous avons développé une méthode robuste de générer organites du cerveau pour délimiter les événements précoces du développement du cerveau humain et de modéliser microcéphalie in vitro ^{1, 2, 3.} Il est à noter que nous avons adapté la méthode originale développée par Lancaster et al. pour générer des organites cérébraux ^1. Cette méthode a été modifiée en fonction de nos exigences expérimentales.

Le but d'une étude de Gabriel et al. était d'analyser les mécanismes cellulaires et moléculaires de l'entretien des cellules souches neurales au cours du développement du cerveau. Pour ce faire, une étude mécaniste a été réalisée en analysant les cellules progénitrices neurales (PNJ) dans organites du cerveau 3D provenant d'un patient microcéphalie ^4. Ce patient effectue une mutation dans CPAP, une protéine centrosomale conservée nécessaire pour biogenèse centrosome ^5. Une hypo largement acceptéethèse est que microcephaly est le résultat d'une diminution de la piscine de l' APN, et cela peut être dû soit à la mort cellulaire ou de différenciation précoce ^{1, 6, 7, 8, 9.}

En analysant les zones ventriculaires (VZS) de organites du cerveau microcéphalie, il a été montré qu'un nombre important de PNJ subissent une division cellulaire asymétrique, contrairement organites du cerveau provenant d'un donneur sain ^4. De nombreuses analyses microscopiques et biochimiques des organites du cerveau microcéphalie ont révélé un rôle inattendu pour la PPC dans le démontage de ⁴ cil en temps opportun. Plus précisément, CPAP mutée est associée à un démontage de cil retardé et le cycle cellulaire retardée ré-entrée, ce qui conduit à la différenciation prématurée des NPC ^4. Ces résultats suggèrent un rôle dans microcéphalie et cilia eimplication EIR lors du contrôle de la neurogenèse et la taille du cerveau ^10.

La première partie de ce protocole est une description d'un procédé en trois étapes pour générer des organites homogènes du cerveau. Comme mentionné précédemment, le protocole de Lancaster original a été adapté et modifié en fonction de notre objectif ^1. Tout d'abord, iPSCs humains sont cultivées dans un état opérationnel sans matrice définie sur Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Cette étape permet d'éviter les variations des cultures de cellules souches pluripotentes dépendant de l'alimentation. Dans ce protocole, l'induction de la différenciation de neurones pour former un épithélium neural commence directement à partir de iPSCs. En sautant l'étape de formation corps embryoïdes (EB), le produit de différenciation de neurones, d'une manière plus contrôlée et dirigée. Cette approche limite la formation spontanée et non orienté d'autres couches de cellules germinales, tels que le mésoderme et l'endoderme. En appliquant ce protocole, neurosphères contenant des rosettes de neurones peuvent être récoltées au jour 5 pour EHS enrobage de matrice et une culture en suspension stationnaire. Le milieu organoïde utilisé pour la troisième étape de notre protocole est complété par dorsomorphin et SB431542. Dorsomorphin est un inhibiteur de petite molécule de protéine morphogénique osseuse (BMP), et SB431542 inhibe la TGFß / activine / voie de signalisation nodal. La combinaison de ces facteurs pourrait favoriser la différenciation neuronale plus efficace que l' acide rétinoïque seul ^{11, 12, 13, 14.}

Au total, ces modifications permettent la génération reproductible de organites du cerveau, avec des variations minimes à travers organites. Fait important, cette méthode a été appliquée pour générer des organites robuste du cerveau microcéphales de iPSCs patients qui portent des mutations dans des gènes qui affectent centrosomes et de la dynamique du cycle cellulaire.

La seconde partie de ce protocole donne des instructions pour préparer brain organites pour l'analyse et l'interprétation des défauts cellulaires dans microcéphalie. Cela comprend la fixation, cryosectioning, immunofluorescence et analyse microscopique confocale. Ce protocole fournira au lecteur une description détaillée des résultats attendus et des conseils d'interprétation.