확산 내장 뇌교 신경 교종의 신속한 사후 세포 배양을위한 프로토콜 (DIPG)

이 프로토콜은 모든 환자 데이터의 적절한 드 식별과의 제도적 검토 보드에서 인간의 복지에 대한 모든, 기관 국가 및 국제 가이드 라인에 따라 승인을 수행하고있다. 이전에이 프로토콜 작업에 대한 환자의 가족에서 모든 해당 기관 검토위원회의 승인과 동의를 얻습니다. 1. 조직 샘플을 얻기 참고 :이 프로토콜의 중요한 구성 요소는 부검시 즉시 시작하는 조직 기증의 적절한 처리가 필요합니다. 전체 샘플 가능성은 즉시 항생제 / 항진균제로 보충 적절한 냉각 매체로 조직을 전송의 사후 간격 (PMI)를 최소화하는 교통 전반에 걸쳐 젖은 얼음에 샘플을 유지하고, 프로토콜에 걸쳐 무균 기술을 유지에 크게 의존한다. 통지시임박한 기부의 샘플 채취 키트를 준비합니다. 다음의 재료는 직접 조직 샘플의 복귀 운송을 위해 사용될 수있는 단열 용기 운송 박스를 포함하여 : 멸균 장갑, 커튼, 그리고 메스를 포함하여 멸균 준비를위한 자료를 포함합니다. 얼음이나 차가운 팩 단열 용기에 30 mL의 전달 매체를 포함하는 10 멸균 50 ML 원뿔 튜브 – (8)를 포함합니다. 주 : 표준 세포 배양 배지가 작동 할 수 있지만, 가장 가능성이 샘플 항진균제 / 항생제가 보충 절전-A로 구해진다. 다른 분석 (예를 들어, 고정 제)에 대한 추가 샘플 튜브를 포함합니다. 부검은 연구자의 사이트에서 수행하지 않을 경우, 명확하게 종양 샘플을 수집하는 방법을 내용의 문서를 포함한다. 이는 너와 같은 중뇌 및 수질에서 샘플을, 불임을 유지 젖은 얼음 샘플 튜브를 유지, 등 등의 세부 사항을 포함MOR 세포는 종종이 지역을 침공. 부검 동안 불임을 유지한다. 두개골 내부의 무균 뇌를 고려, 그래서 두개골이 열려 번 (변경 장갑 포함) 멸균 기술을 관찰합니다. 피부와 머리 오염을 방지하는 것이 중요합니다. 복부 측면에서 종양 해부 (뇌교의 "배"를 보충 그림 1 참조). 멸균 메스로 종양에서 작은 1cm 덩어리를 잘라 즉시 차가운 배송 미디어 (단계 1.1.2의 주 참조)로 전송하고 젖은 얼음에 넣어. 40 mL를 각 튜브의 조직과 미디어의 최종 부피 결과, 각각의 튜브에 조직의 10 ㎖를 놓습니다. 주 : DIPG의 경우에는 종양이 확산 자주 뇌교 및 뇌간 나머지 침투. 뇌교에서 – (40㎖의 조직 30) 및 1-4 튜브 – 중뇌 및 골수에서 – (20 ㎖ 조직 10) 각각이 관과 같은 통상적으로 3 포함한 가능한 샘플만큼 수집한다. 샘 수집중뇌 및 수질에서 PLES는 종종 많은 종양 세포를 포함하는 뇌교에 병치. 샘플 수집 후, 단열 용기에 젖은 얼음 샘플 O / N를 제공. 동결 세포를 죽일으로, 드라이 아이스에 샘플을 제공하지 마십시오. 샘플 처리를위한 2. 준비 이전 샘플 준비를 시작으로, 1 시간 동안 UV 광 하에서 면도날 곡선 지혈제, 기타 비 멸균 도구와 함께 조직 배양 후드 살균. 배양의 오염을 방지하기 위해 멸균 조건 하에서 다음의 모든 단계를 수행한다. 준비 및 살균 필터 솔루션을 제공합니다. 1.8 M 수크로오스 용액을 조제 증류수 300 ㎖의 308.07 g 자당을 녹인다. 추가 50 mL의 10 배 칼슘 또는 마그네슘없이 식염수 솔루션 (HBSS)을 Hank's은 버퍼 증류수를 사용하여 500 mL의 전체 볼륨을 가지고. 4 ℃에서 보관하십시오. 소화 효소 용액을 제조, (5)을0 ㎖의 다진 조직마다 10 ㎖ 칼슘 및 마그네슘 HBSS 500 μL 5 ㎎ / ㎖의 데 옥시 리보 뉴 클레아 제 I (최종 농도를 50㎍ / ㎖) 500 μL 2.5 ㎎ / ㎖의 콜라게나 제의 I / II 및 디스 파제 용액 (최종 농도 25 추가 μg의 / ㎖) 500 μL, 1 M HEPES 완충액. 37 ° C의 물을 욕조에 Prewarm 소화 솔루션입니다. 종양 줄기 미디어 (TSM)베이스를 준비하려면, 250 mL의로 Neurobasal-A, 250 mL의 둘 베코의 수정 된 이글 매체를 혼합 : 식품 혼합물 F12 (DMEM / F12), 5 ㎖의 100 배의 항생제 항진균제, 5 ㎖의 200 mM의 L 알라 닐 L-를 글루타민 디 펩티드 (루타-A), 5 ㎖ HEPES 완충액 5 ㎖의 100 mM의 피루브산 나트륨, 5 ㎖의 100 × MEM 비 필수 아미노산. TSM베이스에 다음과 같은 보충제를 추가, 성장 인자와 전체 TSM을 준비하려면 다음을 50 배 B27 보충 마이너스 비타민 A (1시 50분), 인간 표피 성장 인자 (H-EGF, 20 NG / ㎖), 인간 섬유 아세포 성장 인자 (H- FGF 20 NG / ㎖), 인간 혈소판 유래 성장 인자 AA (H-PDGF-AA, 10 NG / ㎖)인간 혈소판 유래 성장 인자 BB (H-PDGF-BB, 10 NG / ㎖), 헤파린 용액 (2 μg의 / ㎖). 4 ° C까지 스윙 버킷 로터가 장착 된 실험실 원심 분리기를 사전 냉각. 3. 기계 해리 높은 벽으로 둘러싸인 100mm X 20mm 세포 배양 접시에 조직을 전송합니다. 운송에서 미디어의 나머지를 제거하고 10로 교체 – 15 mL의 차가운 문화 미디어. 만곡 지혈제를 사용하면, 면도날을 파악 명백한 혈관이나 수막을 제거하면서 미세 조직을 말하다. 주 : 최종 조직 절편 1mm보다 작아야한다 (도 1b 참조). 깨끗한 50 ML 원뿔 튜브로 조직을 전송합니다. 추가로 5 mL의 차가운 문화 매체와 세포 배양 접시를 세척하고 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다. 남은 조직을 전송하기 위해 필요한이 세척 단계를 반복합니다. (- 5 회 4) 10 mL의 혈청 학적 피펫을 사용하여 부드럽게를 씹다. 큰 담배 마는 허용UE 단편은 튜브의 바닥에 침전한다. 필요한 경우, 간단히 1 분 (350 XG, 4 °에 C)에 대한 샘플을 원심 분리기. 기계적 해리 분수를 수집합니다. 상층 액을 제거하고 표시된 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 100 μm의 필터를 통해 필터링 "기계 해리." 원래 원뿔 튜브를 통해 필터 전환 및 조직 조각을 복구하기 위해 문화 미디어로 씻는다. 5 분 (350 XG, 4 ° C)은 "기계 해리"부분을 원심 분리기. 펠렛 "기계 해리"부분에서 상층 액을 제거하고 차가운 문화 매체의 조직을 재현 탁. 은 "기계적 해리"원뿔형 튜브 조직 이상 5 ㎖가있는 경우에는 튜브보다 5 ㎖ 조직을 갖고 없도록 다른 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 조직을 분할. (자당 그라데이션 원심 분리 단계까지 인트를 얼음에 기계적 해리 부분을 저장페이지 5). 또한, 기계적 해리 부분은 효소 해리 잠복기 (단계 4.4) 중 5 단계로 진행할 수 있습니다. 4. 효소 해리 나머지 큰 조직편을 함유하는 튜브에 조직 이상 5 ㎖이 경우에는 튜브보다 5 ㎖ 조직을 갖고 없도록 다른 새로운 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 조직을 분할. 5 분 (350 XG, 4 ° C)에 남아있는 조직 절편을 함유하는 원뿔형 튜브 (들)를 원심 분리기. 데워진 효소 소화 솔루션을 뜨는을 제거하고 추가, 매 1 mL의 조직에 대한 5 ㎖ 소화 용액이되도록 (예를 들어, 5 ㎖ 조직 25 mL를 소화 용액). 실험실 필름 원추형 튜브의 뚜껑을 밀폐하고 30 분 동안 37 ° C에서 회 전자에 반응을 배양한다. 배양 후, (그림 1C 참조) 부드럽게 샘플을 씹다. 10 ㎖의 혈청 피펫을 사용하여,피펫 샘플까지 6 다운 – 8 시간. 과도한 공기 방울을 생성하지 마십시오. 피펫의 마지막에 1,000 μL 피펫 팁을 추가하고 추가로 6 씹다 – 8 번. 남아있는 덩어리가 튜브의 바닥에 정착하도록 허용합니다. 제거하고 여전히 "효소 해리"이라는 새로운 50 ML 원뿔 튜브에 100 μm의 필터를 통해 정지 세포와 뜨는을 필터링하고 얼음에 저장합니다. 큰 조직 조각이 남아 있으면, 조각에 칼슘과 마그네슘에 추가로 10 ㎖의 HBSS를 추가하고 반복 3.5.1와 3.5.2 단계를 반복합니다. 은 "효소 해리"튜브에 100 μm의 필터를 통해이 최종 솔루션을 필터링합니다. 5 분 (350 XG, 4 ° C)의 "효소 해리"튜브를 원심 분리기 및 자당 기울기 원심 분리를 계속합니다. 5. 자당 그라데이션 원심 분리 샘플은 아직 용액 centrifu에 현탁하면5 분 (350 XG, 4 ° C)에 대한 GE의. 칼슘과 마그네슘없이 20 mL의 차가운 HBSS에 뜨는 및 재현 탁 조직을 제거합니다. 차가운 HBSS 25 ML의 총 볼륨 업을 가져옵니다. 천천히 25 mL의 1.8 M 자당 솔루션을 추가하고 혼합하는 튜브를 반전. 이것은 0.9 M 자당 기울기가 발생합니다. 10 분 (800 XG, 4 °에 C)에 대한 더 브레이크 원심 분리기. 그라데이션을 방해하고 수율을 감소 (전 원심 분리 후 샘플의 예는 그림 1D 참조)하는 원심 브레이크를 사용. 조심스럽게 수초의 파편과 가능한 한 많은 자당 솔루션을 기음. 칼슘과 마그네슘없이 30 mL의 차가운 HBSS를 추가하고 부드럽게 혼합하여 샘플을 씻으십시오. 5 분 (350 XG, 4 °에 C)에 대한 원심 분리기. 6. ACK 적혈구 용해 세척 뜨는을 제거합니다. 5 mL의 ACK 용해 완충액을 첨가하고 완만하게 RT에서 1 분 동안 튜브를 소용돌이, 세포 펠렛을 재현 탁. 패를 끄다칼슘 및 마그네슘없이 30 ㎖ 차가운 HBSS를 첨가하여이 Analysis. 5 분 (350 XG, 4 °에 C)에 대한 원심 분리기. 7. 초기 문화의 유지 보수 성장 인자 따뜻한 완전한 TSM 15 mL의 트리 판 블루 배타를 이용하여 혈구의 생존 세포 밀도를 정량화 – 10 최종 세포 펠렛을 재현 탁. 참고 : 가능한 세포의 범위는 광범위하게 조직 기증의 상황에 따라 달라집니다 및 정량 인해 남은 세포 파편이 초기 단계에서 어려울 수 있습니다. 이상적인 경우, 샘플 당 백만 살아있는 세포를 가지고하는 것을 목표로하고 있습니다. 과도한 파편은 T175 플라스크에 낮은 밀도로 남아 플레이트의 경우. 새로운 T75 문화 플라스크에 최종 세포 현탁액을 전송합니다. 추가적인 성장 인자 스파이크 전반적인 성장 인자 수준을 유지하고, 종양 세포의 발달 neurosphere를 모니터링하는 격일는 (도 1E 및도 2 참조). 또한, 유동 세포 계측법 및 형광 활성화 셀 정렬을 포함하여 추가 분석을위한 공정 효소 해리 세포. (평균 3 얻어 – 4 주되지만, 최대 2 개월 며칠 범위) neurosphere를 개발 한 결과, 이물질의 양을 감소시키기 위해 100 ㎛의 나일론 메쉬 필터를 사용하여 샘플 필터 역방향. 주 : 여과 액을 실행 가능한 단일 세포 또는 작은 구체가 존재하는 경우에 문화에서 유지되어야한다. 초기 환자 샘플을 비교, 계대 동안 DNA 지문을 수행하여 문화의 무결성과 순도를 확인합니다.