Kwalitatieve en kwantitatieve analyse van de immuun SYNAPS in het menselijke systeem met behulp van Imaging Stroom Cytometry
Summary
Hier beschrijven we een complete workflow voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van immuun synapsen tussen primaire menselijke T-cellen en cellen antigeen-presenteren. De methode is gebaseerd op imaging stroom cytometry, waarmee de verwerving en evaluatie van verscheidene duizend cel beelden binnen een relatief korte periode van tijd.
Abstract
De immuun SYNAPS is het gebied van communicatie tussen T-cellen en antigeen-presenteren cellen (APCs). T-cellen polariseren oppervlakte receptoren en eiwitten naar de immuun SYNAPS signaal uitwisseling te verzekeren van een stabiele binding. Klassieke confocal, TIRF of Super resolutie microscopie zijn gebruikt om het bestuderen van de immuun synaps. Aangezien deze methoden handmatige Beeldacquisitie en tijdrovende kwantificering vereisen, is de beeldvorming van zeldzame gebeurtenissen uitdagend. Hier beschrijven we een workflow waarmee de morfologische analyse van tientallen duizenden cellen. Immuun synapsen veroorzaakt tussen primaire menselijke T-cellen in pan-leukocyte preparaten en Staphylococcus aureus enterotoxine B SEB-geladen Raji cellen als APCs. Beeldacquisitie wordt uitgevoerd met imaging stroom cytometry, ook wel genoemd In-Flow microscopie, die eigenschappen van de cytometer van een stroom en een fluorescentie Microscoop combineert. Een complete gating strategie voor de identificatie van T-cel/APC paren en analyseren van de immuun synapsen wordt verstrekt. Als deze werkstroom kan de analyse van immune synapses in ongezuiverde pan-leukocyte preparaten en vandaar vereist slechts een kleine hoeveelheid bloed (dat wil zeggen, 1 mL), het kan worden toegepast op monsters van patiënten. Nog belangrijker is, kunnen verschillende monsters worden voorbereid, gemeten en geanalyseerd in parallel.
Introduction
T-cellen zijn grote regulatoren van het adaptieve immuunsysteem en worden geactiveerd door middel van antigene peptiden die worden gepresenteerd in het kader van grote comptabiliteit complexen (MHC). Volledige T-cel activatie vereist twee signalen, de bevoegdheid signaal via de antigeen-specifieke T-cel receptor (TCR) / CD3 complex en het costimulatory signaal via accessoire receptoren. Beide signalen worden gegenereerd door de directe interactie van T cellen met antigeen-presenteren cellen (APCs). Volwassen APCs geven het signaal van de bevoegdheid voor T-cel activatie door MHC-peptide complexen, en zij uiten costimulatory liganden (bijvoorbeeld, CD80 of CD86) om te verzekeren van de progressie van T-cel activatie1. Een belangrijke functie van costimulatie is de omlegging van de actine cytoskelet2,3,4. De corticale F-actine is tamelijk statisch in de rust van T-cellen. T-cel stimulatie door antigeen-bevattende APCs leidt tot een ingrijpende herinrichting van het cytoskelet actine. Actin dynamics (dwz, snel actine polymerisatie/depolymerization cirkels) kunnen de T-cellen maken van troepen die worden gebruikt voor het vervoer van proteïnen of organellen, bijvoorbeeld. Het cytoskelet actine is bovendien belangrijk voor de ontwikkeling van een speciale contact zone tussen T-cellen en APCs, genaamd de immuun synaps. Vanwege het belang van het cytoskelet van de actine aan de immuun SYNAPS, het essentieel geworden methoden kwantificeren van veranderingen in het actine cytoskelet van T cellen5,6,7,8 te ontwikkelen , 9.
Door middel van actine cytoskeletal hulp, worden oppervlakte receptoren en signalering eiwitten gescheiden in supramoleculaire activering clusters (SMACs) binnen de immuun synaps. De stabiliteit van de immuun SYNAPS wordt verzekerd door de binding van de receptoren naar F-actine bundels, waardoor de elasticiteit van het cytoskelet van actine. Immuun synapse formatie is aangetoond dat het van doorslaggevend belang voor de generatie van de adaptive immuunrespons. De nadelige gevolgen van een defecte immuun synapse formatie in vivo werden voor het eerst besefte bij patiënten met van Wiskott Aldrich syndroom (WAS), een ziekte in de polymerisatie van welke actine en, gelijktijdig, immuun synapse formatie worden verstoord10 . WAS patiënten kunnen lijden aan eczeem, ernstige recidiverende infecties, auto-immune ziekten en melanomen. Ondanks deze bevinding, is het op dit moment niet bekend of immuun synapse formatie verschilt in de T-cellen van gezonde individuen en patiënten met een immuun afwijkingen of auto-immune ziekten.
Fluorescentie microscopie, confocal waaronder, TIRF en super resolutie microscopie, werden gebruikt om te ontdekken de architectuur van de immuun synapse11,12,13,14. De hoge resolutie van deze systemen en de mogelijkheid om live-cel imaging kunnen de collectie van exacte, spatio-temporele informatie over het cytoskelet actine en oppervlakte of intracellulaire eiwitten in de immuun synaps. Veel resultaten worden gevonden, zijn echter gebaseerd op de analyse van slechts enkele tientallen T-cellen. Bovendien moeten de T-cellen worden gezuiverd voor deze soorten fluorescentie microscopie. Voor veel onderzoeksvragen echter het gebruik van ongezuiverde cellen in plaats van de hoogst mogelijke resolutie van het grootste belang. Dit is relevant als T-cellen van de patiënten worden geanalyseerd, aangezien het bedrag van donorbloed beperkt is en er de noodzaak wellicht voor het verwerken van vele monsters in parallel.
We gevestigde microscopische methoden waarmee de analyse van het cytoskelet van actine in de immuun SYNAPS in de menselijke systeem15,16,17. Deze methoden zijn gebaseerd op imaging stroom cytometry, ook wel genoemd In-Flow microscopie18. Als een hybride tussen multispectrale stroom cytometry en fluorescentie microscopie, imaging stroom cytometry heeft zijn sterke punten in het analyseren van morfologische parameters en eiwit localisatie in heterogene cel populaties, zoals pan-leukocyten van de perifeer bloed. We introduceerden een methodologie waarmee we kunnen kwantificeren F-actine in T-cel/APC geconjugeerde van menselijke T-cellen van de volbloed monsters, zonder de behoefte aan tijdrovende en dure zuivering stappen17. De techniek die hier gepresenteerd omvat de gehele werkstroom, van het krijgen van het bloedmonster naar de kwantificering van F-actine in de immuun synaps.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hier gepresenteerde workflow maakt de kwantificering van immuun synapsen tussen menselijke T cellen (ex vivo) en APCs. Met name werden erytrocyt-lysed pan-leukocyten gebruikt als T-cel-bronnen, T-cel zuivering stappen overbodig maken. De B-cel lymfoom cellijn Raji diende als surrogaat APCs. Dit draagt aanzienlijke voordelen, omdat het maakt vergelijkingen tussen bloeddonoren van de kant van de T-cel van de immuun synaps. Autologe DCs kunnen bovendien nauwelijks rechtstreeks vanaf het perifere bloed. De productie van m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk werd gefinancierd door de Duitse Onderzoeksraad (DFG) met subsidies Nee. SFB-938-M en SA 393/3-4.
Materials
| >Multifuge 3 SR | Heraeus | ||
| RPMI 1640 | LifeTechnologies | #11875085 | 500 mL |
| FCS | Pan Biotech#3302-P101102 | ||
| Polystyrene Round Bottom Tube | Falcon | #352054 | 5 mL |
| Kulturflasche | Thermo Scientific | #178883 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8662 | |
| Bovine Serum Albumin | Roth | #8076.3 | |
| Saponin | Sigma | S7900 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | #16005 | |
| FACS Wash Saponin | PBS 1% BSA 0.15 Saponin | ||
| ReaktiosgefaB | Sarstedt | 72.699.002 | 0.5 mL |
| Speed Bead | Amnis | #400041 | |
| Minishaker MS1 | IKA Works | MS1 | |
| Mikrotiterplatte | Greiner Bio One | #650101 | 96U |
| Enterotoxin SEB | Sigma Aldrich | S4881 | |
| DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | 1:3000 |
| CD3-PeTxR | Invitrogen | MHCD0317 | 1:30 |
| Phalloidin-AF647 | Molecular Probes | A22287 | 1:150 |
| IS100 | Amnis | Imaging flow cytometer | |
| IDEAS | Amnis | Software | |
| INSPIRE | Amnis | Software |
References
- Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
- Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journal of leukocyte biology. 73 (1), 30-48 (2003).
- Samstag, Y., John, I., Wabnitz, G. H. Cofilin: a redox sensitive mediator of actin dynamics during T-cell activation and migration. Immunol Rev. 256 (1), 30-47 (2013).
- Comrie, W. A., Burkhardt, J. K. Action and Traction: Cytoskeletal Control of Receptor Triggering at the Immunological Synapse. Front Immunol. 7, 68 (2016).
- Piragyte, I., Jun, C. D. Actin engine in immunological synapse. Immune Netw. 12 (3), 71-83 (2012).
- Rossy, J., Pageon, S. V., Davis, D. M., Gaus, K. Super-resolution microscopy of the immunological synapse. Curr Opin Immunol. 25 (3), 307-312 (2013).
- Mace, E. M., Orange, J. S. Visualization of the immunological synapse by dual color time-gated stimulated emission depletion (STED) nanoscopy. J Vis Exp. (85), (2014).
- Comrie, W. A., Babich, A., Burkhardt, J. K. F-actin flow drives affinity maturation and spatial organization of LFA-1 at the immunological synapse. J Cell Biol. 208 (4), 475-491 (2015).
- Markey, K. A., Gartlan, K. H., Kuns, R. D., MacDonald, K. P., Hill, G. R. Imaging the immunological synapse between dendritic cells and T cells. J Immunol Methods. 423, 40-44 (2015).
- Bouma, G., Burns, S. O., Thrasher, A. J. Wiskott-Aldrich Syndrome: Immunodeficiency resulting from defective cell migration and impaired immunostimulatory activation. Immunobiology. 214 (9-10), 778-790 (2009).
- Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
- Dustin, M. L., Depoil, D. New insights into the T cell synapse from single molecule techniques. Nature reviews. Immunology. 11 (10), 672-684 (2011).
- Mace, E. M., Orange, J. S. New views of the human NK cell immunological synapse: recent advances enabled by super- and high-resolution imaging techniques. Front Immunol. 3, 421 (2012).
- Yokosuka, T., et al. Newly generated T cell receptor microclusters initiate and sustain T cell activation by recruitment of Zap70 and SLP-76. Nat Immunol. 6 (12), 1253-1262 (2005).
- Wabnitz, G. H., et al. Sustained LFA-1 cluster formation in the immune synapse requires the combined activities of L-plastin and calmodulin. European journal of immunology. 40 (9), 2437-2449 (2010).
- Wabnitz, G. H., et al. L-plastin phosphorylation: a novel target for the immunosuppressive drug dexamethasone in primary human T cells. Eur J Immunol. 41 (11), 3157-3169 (2011).
- Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
- Basiji, D., O’Gorman, M. R. Imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 1-2 (2015).
- Wabnitz, G. H., Samstag, Y. Multiparametric Characterization of Human T-Cell Immune Synapses by InFlow Microscopy. Methods Mol Biol. 1389, 155-166 (2016).
- Balta, E., et al. Qualitative and quantitative analysis of PMN/T-cell interactions by InFlow and super-resolution microscopy. Methods. , (2016).
- Hochweller, K., et al. Dendritic cells control T cell tonic signaling required for responsiveness to foreign antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5931-5936 (2010).
- Balagopalan, L., Sherman, E., Barr, V. A., Samelson, L. E. Imaging techniques for assaying lymphocyte activation in action. Nat Rev Immunol. 11 (1), 21-33 (2011).
