Evaluación de ubicación intracelular de especies reactivas de oxígeno en espermatozoides de Solea Senegalensis
Summary
Este protocolo describe una metodología detallada para detectar la localización de2 H2O en Solea senegalensis espermatozoides con un fluorocromo sensible DCFH-DA para ROS, una mancha de mitocondrias vivo para las mitocondrias y DAPI para núcleos visualización, respectivamente. El protocolo está diseñado para ser realizado dentro de 2 h con espermatozoides frescos o descongelados.
Abstract
El estrés oxidativo es uno de los factores importantes en la disminución de la calidad del esperma. El desarrollo de protocolos eficientes para la detección de especies de oxígeno reactivo (ROS) en espermatozoides es de gran importancia en cualquier especie, pero estos métodos son raramente usados y aún menos en teleósteos. La criopreservación es una técnica útil en acuicultura para diversos propósitos, incluyendo banca de gene y garantizada la disponibilidad de espermatozoides durante todo el año. Procedimientos de congelación/descongelación puede causar producción de ROS y dañar las células de esperma. Teniendo en cuenta los posibles dañan podría causar un exceso de producción de ROS en espermatozoides dependiendo de su localización, aquí una metodología detallada para detectar H2O2 y evaluar su localización intracelular mediante microscopía confocal se proporciona. Para ello, se utiliza una combinación de 3 fluorocromos (2′, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFH-DA), una mancha en mitocondrias y 4′, diclorhidrato 6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)) para evaluar la co-localización de H2O2 con núcleos de espermatozoides o mitocondrias en Solea senegalesis muestras de esperma.
Introduction
La producción de especies reactivas de oxígeno se ha relacionado con la calidad del esperma recientemente1. Aunque la producción de ROS en la mitocondria puede ser considerada un proceso fisiológico normal, estrés oxidativo por exceso de producción de ROS es una causa clara de daño en los espermatozoides en los diferentes niveles. En los seres humanos, el estrés oxidativo se asocia a infertilidad, alteración de la motilidad y la capacidad de someterse a capacitación2; en los mamíferos, el cambio de la integridad del ADN en las muestras de esperma congelado se ha relacionado también a la síntesis de H2O23.
La criopreservación es una técnica común para la banca en acuicultura, gen. Esta tecnología es particularmente importante en las especies con problemas reproductivos como Solea senegalensis. Esta especie valiosa en el mercado muestra disfunción reproductiva en individuos nacidos en cautividad debido a la falta de cortejo. Este hecho hace que la criopreservación de espermatozoides necesario contar con la disponibilidad de espermatozoides para la fertilización artificial. Sin embargo, la criopreservación podría ser una fuente de estrés oxidativo que podría ser perjudicial para los espermatozoides4 como estudios han reportado un efecto beneficioso de la suplementación con antioxidantes. Inhibición de ROS a través de antioxidantes mitocondriales dirigido fue supuestamente beneficiosa para la criopreservación de espermatozoides en el bagre amarillo5.
Por lo tanto, los niveles de ROS en las muestras de semen son importantes conocer, particularmente después de la criopreservación6,7 ya que estas moléculas han sido reconocidas como una desventaja para la supervivencia de la esperma y fertilidad8. Por otra parte, estudiar la distribución de ROS dentro de la célula podría ser crucial para inferir el nivel de daño potencial. Por ejemplo, bajos niveles de ROS en la mitocondria podrían suponerse normal y compatible con la función del esperma, pero altos niveles de ROS en el núcleo podrían ser indicadores de daño del ADN de espermatozoides. H2O2 es uno de los ROS más relevantes que podrían ser liberados de la mitocondria y penetrar en el núcleo porque es una molécula pequeña y sin carga9. Diacetato de Diclorofluoresceína (DCFH-DA) puede revelar específicamente peróxido intracelular emite fluorescencia verde. En este artículo, se presenta un protocolo detallado para detectar la localización intracelular de H2O2 en Solea senegalensis esperma usando microscopia confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es bien sabido que las mitocondrias son orgánulos claves para la motilidad del esperma y la función. Estos orgánulos están implicados simultáneamente directamente en la producción de ROS. Curiosamente, controlados los niveles de ROS son necesarios para el esperma adecuado función1. Relaciones positivas entre la fertilidad y el estrés oxidativo se ha demostrado en mamíferos11 pero niveles excesivos afectan esperma calidad12. Un factor crucial…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a AQUAGAMETE FA 1205 COST Action. Este trabajo fue apoyado por el proyecto AGL201568330-C2-1-R (MINECO/FEDER). David G. Valcarce fue financiado por la Junta de Castilla y León (EDU1084/2012) y el Fondo Social Europeo. Los autores reconocen Dr. Ana Riaza y Stolt Sea Farm S.A., Dr. Paulino de Paz, Dr. Ignacio Martínez Montero y José Ramón Guiérrez. También agradecemos a Paula Fernández Colado por videografía.
Materials
| 2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) | Sigma-Aldrich | D6883 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Confocal Microscopy | Zeiss | LSM800 | |
| Cover slips | Thermo Fisher Scientific | 12-541B | |
| DMSO, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | W387520 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Methanol, Analytical Grade | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| MitoTrackerDeep Red | Thermo Fisher Scientific | M22426 | |
| Microcentrifuge (refrigerated) | Thermo Fisher Scientific | 75002441 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Neubauerchamber | Sigma-Aldrich | BR717810 | |
| Slides | Thermo Fisher Scientific | 10143562BEF |
References
- Amaral, S., et al. Mitochondrial functionality and chemical compound action on sperm function. Curr Med Chem. , (2016).
- Morielli, T., O’Flaherty, C. Oxidative stress impairs function and increases redox protein modifications in human spermatozoa. Reproduction. 149 (1), 113-123 (2015).
- Gürler, H., et al. Effects of cryopreservation on sperm viability, synthesis of reactive oxygen species, and DNA damage of bovine sperm. Theriogenology. , (2016).
- Zhu, Z., et al. Vitamin E Analogue Improves Rabbit Sperm Quality during the Process of Cryopreservation through Its Antioxidative Action. PLoS One. 10 (12), e0145383 (2015).
- Fang, L., et al. Inhibition of ROS production through mitochondria-targeted antioxidant and mitochondrial uncoupling increases post-thaw sperm viability in yellow catfish. Cryobiology. 69 (3), (2014).
- Thomson, L. K., Fleming, S. D., Aitken, R. J., De Iuliis, G. N., Zieschang, J. A., Clark, A. M. Cryopreservation-induced human sperm DNA damage is predominantly mediated by oxidative stress rather than apoptosis. Hum Reprod. 24 (9), 2061-2070 (2009).
- Kim, S. H., Yu, D. H., Kim, Y. J. Effects of cryopreservation on phosphatidylserine translocation, intracellular hydrogen peroxide, and DNA integrity in canine sperm. Theriogenology. 73 (3), (2010).
- Guthrie, H. D., Welch, G. R. Effects of reactive oxygen species on sperm function. Theriogenology. 78 (8), 1700-1708 (2012).
- Aitken, R. J., Jones, K. T., Robertson, S. A. Reactive oxygen species and sperm function–in sickness and in health. J Androl. 33 (6), (2012).
- Valcarce, D. G., Robles, V. Effect of captivity and cryopreservation on ROS production in Solea senegalensis spermatozoa. Reproduction. 152 (5), (2016).
- Gibb, Z., Lambourne, S. R., Aitken, R. J. The paradoxical relationship between stallion fertility and oxidative stress. Biol Reprod. 91 (3), (2014).
- Cabrita, E., et al. Factors enhancing fish sperm quality and emerging tools for sperm analysis. Aquaculture. 432, 389-401 (2014).
