イメージングフローサイトメトリーを使用したT細胞同種反応性の測定

1.必要な試薬類を準備します 2％ウシ胎児血清（FBS）（「洗浄緩衝液」）を含有するリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を調製します。 0.1％の非イオン性界面活性剤を含有する、2％FCSを含むPBSを調製し（「PERM-洗浄緩衝液」を、材料の表を参照のこと）。 1.5％ホルムアルデヒドを含むPBSを準備します。 注：注意！ホルムアルデヒドは、腐食性、潜在的に発癌性であると、適切な個人用保護具を着用したまま処理する必要があります。 PBSは、磁気細胞分離（「MCSバッファ」）、2％FBSおよび0.5mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含有する調製。 ジメチルスルホキシド（DMSO）中で50μg/ mlのファロイジン – フルオレセインイソチオシアネート（FITCファロイジン）を準備。 1mg / mlの核染色を準備（DMSOまたはビス-ベンズイミド色素で、例えば 1mg / mlの7-アミノアクチノマイシンD（7-AAD）;材料の表を参照）をDMSO。目的の細胞のための適切な蛍光色素標識抗体を調製し、イメージングフローサイトメーター。 抗原提示細胞または前駆細胞の供給源としてT細胞と同種の動物組織（ 例えば、脾臓および骨髄）の供給源として動物組織（ 例えば、リンパ節および脾臓）を得ました。 細胞培養培地（ 例えば、ロズウェルパーク記念研究所培地（RPMI）1640または10％FBSを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM））、50μMの2-メルカプトエタノール、ペニシリン、およびストレプトマイシンを準備し得る24および/または96ウェル細胞培養プレート。 2.抗原提示細胞を準備します 注：理論的には、任意のAPC集団はこの方法で調べることができます。未熟マウス骨髄由来樹状細胞（DC）APCは、この場合に訴えられたよう。多くのプロトコルは、（例えば、34および35を参照のこと）、これらの細胞を生成するために存在します。簡単に言えば、以下のプロトコルを使用しました。 RPMへの大腿骨と脛骨からフラッシュ骨髄I 1640またはDMEM。 骨およびデブリの小片を除去するために70μmのセルストレーナーを通して浮遊細胞を渡します。 遠心分離により細胞をペレット化し、次いで、室温で5分間塩化アンモニウム緩衝液を用いて赤血球を溶解します。 遠心分離（400×gで、5分間）により細胞をペレット化し、細胞ペレットを再懸濁します。 遠心分離（400×gで、5分間）によって洗浄緩衝液、ペレットを10mLの、細胞ペレットを再懸濁 – 5で細胞を洗浄します。 ビオチン化抗CD3（5μg/ mlの）、抗B220（5μg/ mlの）、抗MHCクラスII（を1μg/ mL）で、そして抗CD11bで細胞を標識することによって、細胞分離カラム上造血前駆体を豊か（5μg/ mlの）抗体。 遠心分離（400×gで、5分間）により細胞をペレット化し、細胞ペレットを再懸濁。 10分間4℃（材料の表を参照）、抗ビオチン磁性マイクロビーズで細胞をインキュベートします。 洗浄し、細胞をペレット化（400×gで、5分間）および、suspen再大きな正の選択（LS）磁気細胞分離カラムMCS緩衝液3mLでプライミングされ、その磁石に入れを用いて標識細胞を除去する前に、MCS緩衝液1ml中のDそれら。 MCS緩衝液3mLでカラムを3回洗浄します。フロースルーは、所望の細胞を含有するであろう。 培養RPMI 1640またはDMEM中で6日間カラムを通過する細胞は、2 / mlの組換えマウス顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）および2 ngの組換えヒトトランスフォーミング増殖因子β1（TGFβ1）/ mLのを補充しました。 2 NG / mLのGM-CSFおよびTGFβ1を含有する新鮮な完全培地で2日ごとに培地の半分を交換してください。 注：ヒトTGFβ1は、マウスの細胞で活性を有しています。データは、これらの未成熟DCを使用して生成されています。他の細胞（ 例えば、B細胞および成熟DC）は、抗原提示細胞として適しているかもしれませんが、このアッセイでテストされていません。 90％血清/ 10％DMSO及び液体窒素中店でDCを凍結保存。上の回復使用日。使用する前に、トリパンブルー排除を使用して、血球計数器で実行可能なDCの数を数えます。適切な密度で培養培地中で細胞ペレットを再懸濁部4において使用する前に（ステップ4.1参照）。 3. T細胞を調製細胞への活性化または抑制シグナルを伝達する不注意を避けるために、負の選択方法を使用します。 注：この例では、CD4 + T細胞を、分析のために調製されます。 マウス脾臓からCD4 + T細胞を調製するために、注射器のプランジャーを用いて70ミクロンの細胞ストレーナーを通して脾臓をマッシュ。洗浄バッファーで細胞ストレーナーを洗浄します。 遠心分離により懸濁した細胞（400×gで、5分間）をペレット化し、次いで、室温で5分間塩化アンモニウム緩衝液中でペレットを再懸濁することによって赤血球を溶解します。 遠心分離（400×gで、5分間）により細胞をペレット化し、ペレットを再懸濁。 セルを洗います5 S – 遠心分離によって洗浄緩衝液及びペレットを10mL（400×gで、5分間）。ペレットを再懸濁。 CD8、主要組織適合性複合体クラスII（MHC II、を1μg/ mL）で、およびCD19（5μg/ mlの）に対するビオチン化抗体で細胞を染色します。 4℃で10分間インキュベートします。 遠心分離（400×gで、5分間）によって洗浄緩衝液及びペレットを10mLの細胞を洗浄します。ペレットを再懸濁。 製造業者の指示に従って抗ビオチン磁性マイクロビーズ（材料の表を参照）で細胞をインキュベートします。 遠心分離（400×gで、5分間）によって洗浄緩衝液及びペレットを10mLの細胞を洗浄します。ペレットを再懸濁。 MCS緩衝液1ml中に細胞を再懸濁し、マグネットで3mLのMCSの緩衝液でプライミング磁気細胞分離カラム上にCD4 + T細胞を濃縮します。 MCS緩衝液3mLでカラムを3回洗浄します。カラムのフロースルーは、濃縮T細胞が含まれています。 標準フローcytomeにより、負に選択された細胞のアリコートを使用して、T細胞の純度を評価し、試みます。蛍光色素 – ストレプトアビジンコンジュゲート（カラム上で除去されているはずの任意のビオチン標識された細胞を同定するため）および目的のT細胞集団を同定するための抗体または抗体（この場合はCD4）を用いて細胞を染色。 ≥85％の純度が許容される23です。 トリパンブルー排除（≥90％の生存率が許容される）によって血球計でT細胞を数えます。 注：MCSバッファは、アッセイの前に削除する必要がありEDTAが含まれています。これを達成するために、遠心分離（400×gで、5分間）により細胞をペレット化し、洗浄緩衝液1mlで洗浄します。再び細胞をペレット化し（400×gで、5分間）し、適切な密度で培養培地中に再懸濁し（ステップ4.1参照）。 4. T細胞およびDCを共培養 1 T：2でシードT細胞およびDCを24ウェルまたは96ウェル細胞培養プレート中のDC比。確認しておいて最終培養容積は≤50024ウェルプレート用μLまたは96ウェルプレート用≤50μLです。 注：小規模なボリュームは、細胞間相互作用を促し、その後の固定バッファ用のスペースを確保します。 経験的に、正確な細胞数を調整したが、一般的な指針として、1×10 6 T細胞およびウェルあたり0.5×10 6のDC（96ウェルプレート）を使用します。少数の細胞を使用する免疫シナプスの列挙が難しくなるため、これらは、細胞の最小数の考慮されるべきです。 細胞数を増やすには、ステップ5（固定） した後、複製ウェルとプールを設定。 注：複製ウェルをセットアップするとき、すべてのウェルで全てのウェルで最初にしてシードT細胞を樹状細胞に接種することをお勧めします。これは、ウェル間のインキュベーション時間の矛盾を最小限に抑えます。 5％CO 2雰囲気中、37℃で4時間、プレートをインキュベートします。 e_title "> 5。プレート中の細胞を修正各ウェルにPBS中の1.5％ホルムアルデヒドの3回の培養体積を追加し、室温で30分間インキュベートします。 TTは、細胞 – 細胞相互作用の破壊を最小限にするために前板からそれらを除去する細胞を固定することが重要です。 その後の洗浄および染色のためにチューブにプレートに細胞を移します。この段階では、単一の染色コントロールの追加の細胞を取っておきます。離れてこれらのコントロールから、全培養は、抗体カクテル（ステップ4.1.1を参照）で染色されるべきです。 6.染色細胞室温で30分間、所望の蛍光標識抗体のカクテルを含有する洗浄緩衝液100μlで染色細胞は、光から保護しました。 注：カクテルは、T細胞特異的およびAPC特異的抗体が含まれます。蛍光色素は、それらがイメージングフローサイトメータの構成を使用して区別することができるように選択されるべきです。トンでここに示されている彼の実験、青色蛍光団共役CD11bおよびAPC共役CD90.2（5μg/ mlの）を使用した（5μg/ mlのは、材料の表を参照のこと）。 400×gで5分間、洗浄緩衝液及び遠心1mLに細胞を洗浄します。 上清をデカントします。 0.05~0.5μgの/ mLでファロイジンFITC含有PERM-洗浄緩衝液中で細胞を再懸濁し、光から保護し、室温で30分間インキュベートします。 注：約0.1μg/ mLでのファロイジンFITC濃度はマウス細胞ではうまく機能するが、適切な濃度は、サプライヤ、細胞タイプによって異なり、及びイメージングフローサイトメーターが期待されます。 400×gで5分間PERM /洗浄緩衝液および遠心1mLに細胞を洗浄します。上清をデカントします。適切な濃度の核染料（ 例えば、約25 / mlの7-AAD）を含むPERM /洗浄緩衝液中で細胞を再懸濁し、光から保護し、室温で30分間インキュベートします。 セルを洗います400×gで5分間PERM /洗浄緩衝液および遠心1mL中のS。上清をデカントします。洗浄緩衝液、ペレットに細胞を1回洗浄し、50に再サスペンド – 小、キャップされたマイクロ遠心チューブに細胞を移す、洗浄緩衝液100μL。 直ちにデータ収集に進むまたはフローサイトメーター撮像前に取得に数日間まで光から保護し、4℃で細胞を保存します。 注：細胞が正常に7日間まで、このように格納されています。長期保存が可能かもしれないが、テストされていません。 7.獲得データ製造元の指示に従ってイメージングフローサイトメーターを初期化して設定します。任意のデータを収集する前にフローコアの安定性を確保します。 明視野画像取得のための1つのチャネルを予約。明視野チャンネルがオフで単染色制御データを取得します。 「ロード」ボタンとinseをクリックしてください完全に染色された試料ホルダーに（必要なすべての蛍光色素で染色された試料）を含有するチューブを室温。 「ワークスペース」ウィンドウで、選択してアスペクト比が1に近いある領域とゲートシングレット上アスペクト比を有する新たな散布図を作成し（横軸におけるチャネルの強度）に使用される各チャネルのための新しい散布図を作成します。 各蛍光色素について、陽性集団をチェックし、必要であれば、「イルミネーション」ボックスにレーザー電圧を調整します。 チューブをアンロードし、初のシングル染色されたチューブをロードします。 「取得設定」ボックスで、サンプル名を入力し、収集されなければならないイベントの数を設定します。それは（補償制御のための）単一の染色である場合1,000 – 2,000イベントが十分です。 「チャンネル」ボックスで、各サンプルを用いて染色されたチャンネルを選択します。シングルステインコントロールの場合、すべてのチャネルがbrightfで選択する必要がありますieldおよび側方散乱オフ。 「取得」ボックスの下に「録音」ボタンをクリックします。イベントの数が指定されたしきい値に達した場合、買収は自動的に停止します。 チューブをアンロードするために「戻る」ボタンをクリックしてください。各単一染色制御用7.2.6 – を繰り返して、7.2.4を繰り返します。サイトメーターおよびソフトウェアに応じて、取得中、図1に示したゲートの全て設定することはできないかもしれない（より正確なゲーティングは、分析中に実行されると、セクション8を参照します）。 （ステップ7.2）で単染色した試料の場合と同様のサンプルを取得するが、「チャネル」ボックスに、明視野チャネルを含む必要なすべてのチャネルを選択。 データを記録する前に、チャネル強度が所望の細胞集団を同定するための適切であることを確認するチェック。そうでない場合、ステップ7.2で説明したように、レーザー設定と新しい設定を使用して再記録単染色コントロールを調整します。 それぞれについて、サンプルは、数十のイベントの何千ものを取得します。 注：ほとんどの条件下では、細胞-細胞接触イベントは、総細胞数（ほとんどは単一細胞である）の少数派です。一般的には、最終的な膜のコンタクトゲート少なくとも100個の事象を有することが望ましいです。 8.データの分析 （;材料の表を参照してくださいユーザーアカウントが作成されなければならない）、製造元のWebサイトから無料で入手可能な分析ソフトウェアを使用してサイトメータイメージングフローに取得したデータを分析します。 図1のゲーティング戦略は、アロ反応性免疫シナプスを識別するために使用されます。イベントがルートに基づいて、細胞画像を確認して、すべてのイベントからのゲートされる合焦A.を明ちゃんを用いた画像強度プロファイル（勾配RMS）の変化率の二乗平均しますNEL（チャンネル4、CH04）、テキストに記載されているように。 B.を合焦イベントのうち、ダブレットは、明視野チャンネルのための領域に対するアスペクト比をプロットすることによって単一の細胞から区別されます。ダブレットが0.5に近い、より大きな面積を有しながら、単セルは、密接1のアスペクト比をクラスター化し、より小さい面積を有しています。 C。 APCの蛍光強度は（この場合には、樹状細胞（DC）マーカー、のCD11c）を（この場合、CD90.2）T細胞マーカーの蛍光強度に対してプロットされ、そして二重陽性事象がゲートされます。ゲートの国境は、国境近くのイベントの画像をレビューすることによって洗練することができます。それらはAPCマーカー（CD11cの、CH02）の面積に対する縦横比をプロットすることによってのみAPCを含むようD. T-APCダブレットは、その後、精製されています。彼らはエリアに対するアスペクト比をプロットすることによってのみつのT細胞を含むようにE.これらの単-APCダブレットは、その後、精製されT細胞マーカーの（CD90.2、CH06）。 F.最後に 、唯一の2つの核を含むイベントは、わずか2 7-AAD陽性スポット（ すなわち、核）を含有し、イベントを核染色チャンネル（7-AAD、Ch05）上のスポット数のヒストグラムをプロットし、ゲーティングすることによって選択されています。 図2で説明したように、このゲートのイベントは、膜接触およびシナプス形成のために分析されます。データは、処置割り当てに対して盲検で分析し、以前に公開された実験23からのものであるしました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 注：ゲーティング戦略は、このセクションに記載されており、 図1に示されています。サイトメトリーデータの撮像フローの分析は、治療割り当てに関して盲検様式で行われるべきです。我々は、免疫シナプスと非synaptiと信じていますが、C接点（下記参照及び2及び3 図 ）、画像解析に固有の主観性に起因するバイアスを最小限に抑えるべきであるブラインド一般に容易に区別されます。 補償ウィザードにシングルステインコントロール・データ・ファイルをロードすることによって補償行列を生成します。単一染色ファイルをロードした後、実験に使用される蛍光のチャンネルを選択します。 注：ソフトウェアが自動的に補償行列を生成し、これは、手動で正しい正の集団を選択したことを確認するために検証する必要があります。 行列の値をダブルクリックして、解析領域にグラフを追加します。必要に応じて、任意の死細胞/二重/偽陽性を除外するために、新たなゲートを作成します。この新しい洗練された陽性集団は、各チャネルのドロップダウンメニューで、マトリックスボックスで選択することができます。 各チャンネルのためにこれを繰り返します。 compensatioを保存するために「完了」をクリックします。N行列（.ctmファイル）。 解析ソフトウェアに.rifファイルをロードし、補償マトリックスを適用することにより、RAWファイル（.rif）からデータ解析ファイル（.daf）を得ました。 データがロードされると、T細胞APCの接触イベントを識別するためにゲーティング行います。 注：典型的なゲーティング戦略は、インフォーカスイベントを識別するサイズ条件（イベントのアスペクト比対面積）に基づいて、二重に選択し、T細胞のための二重陽性である事象としてT細胞APCダブレットを選択することを含むとAPCマーカー（ 図1A-C）。 注：アスペクト比がダブレット（0.5に近い比）からの単一細胞（1に近い比）の識別を可能にする、その高さにイベントの幅の比です。 明視野チャンネル（ 図1A）の撮像強度プロファイル（勾配RMS）の変化率の二乗平均平方根をプロットすることによりインフォーカスイベント識別。目をクリックします電子勾配RMSヒストグラムは、個々のビン内の細胞のイベントを表示し、焦点外のイベントを除くゲートを配置します。 明視野チャンネルのアスペクト比対面積をプロットし、イベントの形状と大きさ（ 図1B）に基づくダブレットを特定ゲートを描きます。ちょうどこのゲートの境界線の内側と外側のイベントの画像の見直しは、ゲートのサイズと位置を調整するために、アナリストを助けることができます。次いで、T細胞マーカーの強度が一つの軸に表示され、APCマーカーの強度が他の上に表示されるこれらのダブレットイベントのプロットを構築します。両方のマーカーについて陽性の事象を含むT-APCの二重ゲートを描きます。 T細胞APCダブレットイベントのみ1 T細胞と1 APCを含んで、選択したイベントの中で。 APCマーカーのための領域に対するアスペクト比をプロットすることによって単一のAPC（ 図1D）を含む二重にゲーティングすることによってこれを行います。 T細胞のマークのための領域に対するアスペクト比をプロット単一のT細胞（ 図1E）を含む二重にERおよびゲート。 注：唯一の2つのスポット（ 図1F）のイベントに核染色蛍光およびゲーティングに適用されるようにさらなる改良がスポットカウント機能のヒストグラムをプロットすることによって達成することができます。 いくつかの場合において、ダブレット内の二つのセルは接触することはないであろう。互いに接触した細胞を同定するために、APCおよびT細胞のオブジェクトマスクを定義します。 マスクマネージャを開き、新しいマスクを定義するにはAnalysisメニューで「マスク」オプションを使用します。 など、名前を入力し、「T細胞オブジェクトマスク」。 「機能」ボタンをクリックすると、ダイアログボックスで、選択した「オブジェクトを。」 T細胞マーカーが検出されたチャネル（ 例えば、CH06）を選択します。 "OK" をクリックします。 注：「オブジェクト（M06、CH06、タイト）は、」関数のボックスに表示されます。このデフォルトのオブジェクトマスク通常WORうまくKSしかし、最適化が必要な場合があります。 適切なチャネルでのAPCのオブジェクトマスクを作成するには、このプロセスを繰り返します。 APCおよびT細胞のマスクを識別した後、T細胞オブジェクトマスクにおけるAPCの蛍光強度に対するAPCのオブジェクトマスクのT細胞マーカーの蛍光強度をプロットすることにより膜接触を決定します。このプロットでは、互いに接触している細胞のみを含んでゲートを描きます。 注：典型的には、かなり明確な二重陽性および二重陰性集団（ 図2A）があります。 正二重および二重陰性集団の間の境界は、接触している細胞は、ゲート内と接触している細胞ではないが除外されていることであることを保証するために、境界領域内の細胞の明視野画像を確認して設定することができます。 この段階では、手動でシンプルな細胞 – 細胞接触から成熟した免疫シナプスを区別するために、このゲート内のイベントのファロイジンFITC画像を確認します。 Uこれらの画像をマークする「タグ画像」機能をSE。 注：このゲート内のタグ付けされたイベント（免疫シナプス）の割合は、研究されたT細胞集団で直接アロ反応性の指標として使用することができます。