JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
免疫与感染

Görüntüleme Akım Sitometri Kullanımı T Hücresi alloreaktivitesini Ölçümü

Published: April 19, 2017
doi:
10.3791/55283
, , , , ,
1Division of Respirology, Departments of Medicine and Immunology, Toronto Lung Transplant Program, Multiorgan Transplant Program, Toronto General Research Institute,University of Toronto and University Health Network, 2Latner Thoracic Surgery Laboratories, Toronto General Research Institute,University Health Network, 3National Institutes of Health Research, Oxford Biomedical Research Centre, Translational Immunology Laboratory, NDORMS, Kennedy Institute of Rheumatology,University of Oxford, 4Transplantation Research Immunology Group, Nuffield Department of Surgical Sciences, John Radcliffe Hospital,University of Oxford

Summary

Bu kağıt sitometrisi görüntüleme akışı kullanarak T hücrelerinin karışık bir popülasyonda alloreaktivitesini ölçülmesi için bir yöntemi tarif etmektedir.

Abstract

transplant alıcılarında verici antijenleri bağışıklık reaktivitesi ölçümü başarılı azaltılması veya bağışıklık bastırma çekilmesi için önemli olması muhtemeldir. Karışık lökosit reaksiyonu (MLR), sınırlayıcı seyreltme testleri, ve trans-vivo gecikmeli tip hipersensitivite (DTH) deneyi bu soruya uygulanmıştır, ancak bu yöntemler öngörü yeteneği ve / veya bunların yararını azaltmak önemli pratik sınırlamalar sınırlıdır. Görüntüleme akış sitometrisi sitometri floresan mikroskopi görüntüleme yetenekleriyle akışının çok parametreli niceliksel güçlerini birleştiren bir tekniktir. Son zamanlarda verici antijen sunan hücreler (APC'ler) ile olgun bir bağışıklık sinaps oluşturabilen alıcı T hücrelerinin oranını tanımlamak için bir görüntüleme akış sitometri yaklaşımın kullanımı. Iyi karakterize fare kalp transplant modelinde kullanarak, göstermiştir ki, T-APC Membr arasında, in vitro bağışıklık sinaps sıklığıane kontak olayları şiddetle allogreft reddi, hoşgörü içinde sonucunu ve nakli hayatta kalma kaynaklı düzenleyici T hücreleri bağlı olan bir durum öngördü. T-APC, kontakların frekans akut ret esnasında farelerde T hücreleri ile artarak alloantijen yanıtsız hale farelerinden alınan T hücreleri ile azalmıştır. In vitro sistemde düzenleyici T hücrelerinin eklenmesi uzun T-APC temas azaltmıştır. Kritik olarak, bu etki, aynı zamanda, doğal olarak insancıllaştırılmış bir fare modellerinde insan doku reddini kontrol etmek için bilinen regülatör T hücreleri, ortaya çıkan genleşmiş insan poliklonal görüldü. Bu yaklaşım daha da geliştirilmesi, transplant alıcılarında alloreaktif T hücre bölmesine daha derin bir karakterizasyonu için izin verebilir. Gelecekte, daha da geliştirilmesi ve insan hücreleri kullanılarak da bu yöntemin değerlendirme immünosupresyon minimize hastaları seçmek için kullanılan tahliller için bir temel oluşturabilir ve tolerojen etkisini ölçmek için kullanılabiliric klinikte terapiler.

Introduction

Katı organ transplantasyonu, böbrek, karaciğer, kalp ve akciğerlerin son evre hastalık ile hastaların tedavisini dönüştürdü. immünosupresif ilaçların kullanıldığı takdirde büyük ve küçük doku uygunluk antijenleri de farklılıklara nedeniyle, ancak, allograftları derhal alıcı T hücreleri tarafından reddedilir. Bu ajanlar kanser ve organ işlev bozukluğu için riskler de dahil olmak üzere çok sayıda olumsuz etkilere sahiptir. Önemli bir klinik amaç alograft reddini önlediği için gereken minimum seviyeye immunsupresyonun dozunu düşürmek etmektir. Bu düzey, doğuştan gelen bağışıklık sistemi aktivasyonu derecesine bağlı olarak değişiklik gösterebilir olasıdır; alıcı ve verici arasındaki alloantijeni uyumsuzluğu derecesi; bağışıklık sistemi, farmakokinetik ve farmakodinamik ve hastalar arası farklar.

Ne yazık ki, nakil klinisyenler doğru her bir hastada 1 verici reaktivitesini değerlendirmek için bir alet gerekmez. karışıklökosit reaksiyonu (MLR), verici reaktivitesi tespit edilebilmiştir, ancak güvenilir bir aşı sonucu 2, 3 tahmin başarısız olur. , Sınırlayıcı seyreltme testleri, sitokin ELISPORTS ve trans-vivo deney, ya yanıtların sınırlı olarak ölçülmesi veya işletme tolerans 9, 10, 11 ile ilgili 4, 5, 6, 7, 8 .Gene ifade profilleri ortaya koymuştur imzalar pratik değildir 12 ve ret 13, 14, 15, ancak bu her zaman popülasyonlar 16 boyunca genellenebilir değildir ve sonuç olarak, hastalarda sınırlı fayda olabilir. Sıra tabanlı analyMLR 18, kanda 17 ya da çoğalan T hücrelerinin, T-hücre reseptörü (TCR) ses de geliştirilmiştir ama daha fazla doğrulama gerektirmez.

Kavramsal olarak, bir verici antijeni ile alıcı T-hücresi aktivasyonu erken gerekli adımları saptayan bir deney için istenebilecektir. eserleri tanıtabilirsiniz (MLR'deki gibi) gün içinde hücrelerin kültürünün beri böyle bir test ideal olarak bu tür çoğalması veya efektör fonksiyonu olarak mansap olaylar ölçümünü gerektirir olmaz. Test sadece tanımlayıcı değerlendirmeler için, T-hücresi işlevinin bir elemanına bağlıdır için Aynı şekilde, ancak, aynı zamanda arzu edilir (Örneğin, TCR sekanslama) anerjik ve fonksiyonel T hücreleri arasında ayrım yapamaz olabilir.

Çok sayıda çalışma, uzun süreli, T-APC temas önemli bir ilk bir immün sinaps oluşumu için gerekli olduğunu göstermiştirT-hücresi yanıtı 19, 20, 21, 22 devreye girer. Fare% 10 CD4 + T hücreleri allojenik kemik iliği türevli dendritik hücreleri (BMDC) 23 ile uzun süreli temas oluştururlar – Son zamanlarda in vitro zaman atlamalı görüntüleme, yaklaşık 5 dinamik sırasında bildirmiştir. Uzun süreli temas frekans farelerde daha önce aynı antijenlere karşı toleranslı hale getirilmiş ise, bir aşı reddedilen hayvanlarda artmıştır, bu untransplanted farelerde 23 görülen seviyelerde kalmıştır. Uzun süreli etkileşimleri alıcı Tregs varlığında indirgenir ve yokluğunda artan ve insan T hücrelerini ve alojenik monosit türevli DCler (MoDC'ler) 23 kullanılarak benzer olguları gözlenmiştir.

Bununla birlikte, uzun süreli kontakların numara sisteminin, bir poliklonal T hücre populatio içinde yapılann zaman alıcı ve emek yoğun olduğunu. Bu nedenle görüntülemenin kullanımı allojenik bağışıklık sinaps oluşumunu incelemek için akım sitometri yaptı. Görüntüleme akış sitometrisi sitometri floresan mikroskopi tek hücreli görüntüleme yetenekleri ile geleneksel akışının multiparametrik veri toplama ve analiz yeteneklerini de içeriyor. Bu teknik, tek klonlu T hücreleri 24, 26, 27 ya da süper antijenler 28 varlığında bağışıklık sinaps oluşumunu çalışmak için, diğer araştırmacılar tarafından kullanılmıştır. Alloreaktif T hücreleri genel olarak, toplam T hücre repertuarının 29, 30, 31, 32% 5-15 oluşturduğu tahmin edilmektedir, oysa Böyle durumlarda, ancak, tepki veren T hücreleri frekansı, 30-100% arasında değişmektedir. Önemli olan, biz görüntüleme akış sitometri av üretebilir olduğunu gösterdieri alloreaktif T-hücresi frekansı 23 ve bir poliklonal T hücre popülasyonu içinde sinaps frekansında değişiklikler aşı sonucu 23 belirtisi olduğu benzer ölçer. Şu anda, bu yaklaşım ilke olarak, CD4 + T hücrelerinin doğrudan alloreaktivitesini ölçmek için optimize edildi, ama, aynı zamanda CD8 + T hücreleri ve dolaylı yolu incelemek için geliştirilebilir. Dolaylı alloreaktivitesini Nakil sonrası 33 daha uzun zamanlarda kullanıcılar artan inanılmaktadır. Şu anda hastalarda test etmek için izin verecektir insan hücreleri, kullanmak için bu yöntemi geliştiriyorlar. Bu nedenle gelecekte, genel yaklaşım, nakilden önce transplant alıcılarında, T-hücre yanıtlarının fonksiyonel değerlendirme için yararlı olabilir; hemen nakli sonrası; ve uzun vadede, ne zaman ilaç minimizasyonu önemli bir hedeftir haline gelir.

Protocol

1. Reaktifler ve Malzeme Gerekli hazırlayın % 2 cenin sığır serumu (FBS) ( "yıkama tamponu") içeren fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın. % 0.1 noniyonik deterjan içeren% 2 FCS ile PBS hazırlama ( "perma yıkama tamponu"; Malzemelerin Tablo). % 1.5 formaldehit ile PBS hazırlayın. NOT: DİKKAT! Formaldehit aşındırıcı ve potansiyel kanserojen ve uygun kişisel koruyucu ekipman giyerek ele alınması gerekir. PBS,% 2 FBS ve manyetik hücre ayırma ( "MCS tamponu") için, 0.5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ihtiva eden hazırlayın. Hazırlama 50 ug, dimetil sülfoksitte / ml falloidin-floresin izotiyosiyanat (Phalloidın-FITC) (DMSO). 1 mg / ml, nükleer boya hazırlayın (örneğin, 1 mg / DMSO ya da bis-benzimid boyada ml 7-aminoactinomycin D (7-AAD); Malzemelerin Tablo) DMSO içinde. ilgi konusu hücreler için uygun florokrom etiketli antikorlar hazırlamak vegörüntüleme akış sitometresi. Antijen sunan hücreler veya progenitörlerin kaynağı olarak T hücreleri ve allojenik hayvan dokularında (örneğin, dalak ve kemik iliği) bir kaynağı olarak hayvan dokuları (örneğin, lenf düğümleri ve dalak) elde edilir. Hücre kültür ortamı (örneğin, Roswell Park Memorial Institute ortamı (RPMI) 1640 veya% 10 FBS ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM)), 50 uM 2-merkaptoetanol, penisilin ve streptomisin hazırlamak ve elde 24- ve / veya 96- hücre kültür levhaları de. 2. antijen sunan hücreler hazırlayın NOT: Teoride, herhangi APC nüfus bu yöntemle incelenebilir. APC 'ler bu durumda dava gibi Olgunlaşmamış fare kemik iliğinden türetilen dendritik hücreler (DC). Birçok protokol (örneğin, 34 ve 35 Referanslar) bu hücrelerin üretilmesi için mevcuttur. Kısaca aşağıdaki protokol kullanıldı. RPM içine uyluk ve kaval kemiklerinden Flush iliğiBen 1640 veya DMEM. kemik ve döküntü küçük parçalar halinde ayrılması için bir 70-mikron hücre süzgecinden süspansiyon hücreleri geçirin. santrifüj ile pelet hücreleri ve daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika için bir amonyum klorür tamponu kullanılarak kırmızı hücreleri lize. Santrifüj (400 xg 5 dakika) Pelet hücreleri ve hücre pelletini. Santrifüj (400 xg 5 dakika) yıkama tamponu, pelet, 10 mL ve hücre topağı yeniden askıya – 5 hücrelerin yıkayın. biyotinlenmiş anti-CD3 (5 ug / ml), anti-B220 (5 ug / ml), bir anti-MHC sınıf II (1 ug / ml) ve anti-CD11b ile hücrelerin etiketlenmesi ile, bir hücre ayırma kolonu üzerinde hematopoietik öncüler zenginleştirilmesi (5 ug / ml) antikorlar. Santrifüj (400 xg 5 dakika) Pelet hücreleri ve hücre topağı yeniden askıya. 10 dakika boyunca 4 ° C'de anti-biyotin, manyetik mikro-boncuklar (Malzemelerin Tablo) kuluçkaya bırakılır. Yıkayıp pelet hücreleri (400 x g, 5 dakika) ve-Asma tavanlar yenidend ise 1 ml MCS tamponu içinde geniş bir pozitif seçim ile MCS tampon 3 mL ile prime ve mıknatıs yerleştirilmiştir (LS) manyetik hücre ayrıştırma sütunu olarak etiketlenmiş hücrelerin, çıkarmadan önce. MCS tampon 3 mL sütun 3 kez yıkayın; akış istenen hücreleri içerecektir. Kültür RPMI 1640 ya da DMEM 6 gün boyunca kolondan geçer hücreleri, 2 ng / ml rekombinant fare granülosit makrofaj koloni stimüle edici faktör (GM-CSF) ve 2 ng ile takviye / yeniden birleştirici insan büyüme faktörüne p1 mL (TGF-p1) . 2 ng / ml GM-CSF ve TGF-P 1 içeren taze ortamla her 2 günde bir yarım orta değiştirin. NOT: İnsan TGF-p1 fare hücrelerinde aktiviteye sahiptir. Veriler, bu olgun olmayan DH'ler kullanılarak oluşturulmuştur. Diğer hücreler (örneğin, B hücreleri ve olgun DH'ler) APC olarak uygun olabilir, ancak, bu deneyde test edilmemiştir. % 90 serum /% 10 DMSO ve sıvı azot içinde depolamak DH'ler cryopreserve; kurtarmakKullanım günü. Kullanımdan önce, tripan mavisi dışlaması ile hemositometrede yaşayabilir DC'lere sayısını. uygun bir yoğunlukta kültür ortamı içinde hücre pelletini askıya yeniden bölüm 4 içinde kullanılmadan önce (adım 4.1). 3. T hücrelerini hazırlamak hücrelere aktive veya inhibe edici sinyalleri iletmek yanlışlıkla önlemek için negatif seçim yöntemlerini kullanın. Not: Bu örnekte, CD4 + T hücreleri analiz için hazırlanır. Fare dalağından alınan CD4 + T hücreleri hazırlamak için, bir şırınga pistonu kullanarak 70 um'lik bir hücre süzgecinden dalak püre. Yıkama tamponu ile hücre süzgecinden yıkayın. santrifüj ile süspansiyon halinde duran hücreleri (400 x g, 5 dakika) Pelet ve daha sonra oda sıcaklığında 5 dakika için bir amonyum klorür tamponu içerisinde pelet yeniden süspansiyon haline kırmızı hücreleri lize. Santrifüj (400 xg 5 dakika) Pelet hücreleri ve pelet yeniden askıya. hücreyi yıkayın5 s – santrifüjleme ile yıkama tamponu ve pelet 10 ml (400 x g, 5 dakika). pelet yeniden askıya. CD8, ana histo-uyumluluk kompleksi sınıf II de (MHC II, 1 ug / ml) ve CD19 (5 ug / ml) için biyotinli antikorlar ile hücrelerin leke. 4 ° C'de 10 dakika süreyle inkübe edilir. santrifüj ile yıkama tamponu ve pelet 10 ml (400 x g, 5 dakika) hücreler yıkanır. pelet yeniden askıya. üreticinin talimatlarına göre anti-biyotin, manyetik mikro-boncuklar (Malzemelerin Tablo) kuluçkaya bırakılır. Santrifüj (400 xg 5 dakika) yıkama tamponu ve pelet, 10 ml hücre yıkayın; pelet yeniden askıya. MCS tampon maddenin 1 mL'si içinde hücrelerin yeniden askıya ve bir mıknatıs üzerinde 3 ml MCS tamponu ile astarlanmış bir manyetik hücre ayrıştırma kolonu üzerinde CD4 + T hücreleri zenginleştirmek. MCS tampon 3 mL sütun 3 kez yıkayın. Sütun akış zenginleştirilmiş T hücrelerini içerir. standart akış cytome tarafındanolumsuz seçilen hücrelerin bir kısım kullanılarak T hücre saflık değerlendirmek, deneyin. ilgi konusu T hücre popülasyonu (bu durumda CD4) tespit etmek ve bir antikor veya antikorlar (kolon üzerinde kaldırılmış gereken herhangi bir biyotin-etiketli hücreleri belirlemek için), bir florokrom-streptavidin konjügatı kullanılarak hücrelerin Leke; ≥85% saflık olarak kabul edilebilir bir 23'tür. tripan mavisi eksklüzyonu ile (≥90% canlılık kabul edilebilir) bir hemositometrede T hücreleri sayın. Not: MCS tamponu, deneyden önce çıkarılmalıdır EDTA ihtiva etmektedir. Bunu gerçekleştirmek için, santrifüj (400 x g, 5 dakika) ile hücrelerinin tane haline getirilmesi ve yıkama tamponu 1 mL yıkayın. Yine hücreler pelet (400 x g, 5 dakika) ve uygun bir yoğunlukta kültür ortamı içinde yeniden askıya (adım 4.1). 4. T hücrelerini ve DCler Co-inkübe Tohum T hücreleri ve DCler, 2: 1, T: 24 kuyulu bir ya da 96-yuvalı hücre kültürü plakasının DC oranı. emin olun Son kültür hacmi ≤500 24 oyuklu plakalar için uL ya da 96 oyuklu plakalar için ≤50 uL'dir. NOT: Daha küçük hacimleri hücre-hücre etkileşimleri teşvik etmek ve daha sonraki sabitleme tampon için yer bırakın. Ampirik olarak hassas hücre sayısını ayarlama, ama genel bir kılavuz olarak, 1 x 10 6 T hücreleri ve oyuk (96 çukurlu plaka) başına 0.5 x 10 6 DC'ler kullanımı. Daha az hücreleri kullanılarak zor bağışıklık sinaps sayımını yapar çünkü bu, hücrelerin minimum numaraları düşünülmelidir. 5. adım (tespit) sonra çoğaltmak kuyu ve havuz kurmak, hücre sayıları arttırmak. NOT: çoğaltma kuyuları kurarken, bu kuyuların hepsinde ilk kuyuların hepsi ve daha sonra tohum T hücrelerinde DC'leri tohuma tavsiye edilir; Bu kuyular arasında inkübasyon süresi içinde tutarsızlıkları en aza indirir. Bir% 5 CO2 atmosferinde 37 ° C 'de 4 saat boyunca inkübasyona bırakılır. e_title "> 5. Plate içinde Hücreleri Fix Her bir oyuğa, PBS içinde% 1.5 Formaldehit ile 3 kez kültür hacmini ekleyin ve 30 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir; tt önce, hücre-hücre etkileşimleri bozulmasını en aza indirmek için plaka çıkardıktan hücreleri gidermek için önemlidir. takiben daha sonraki yıkama ve boyama için tüplere plaka hücreleri aktarın. Bu aşamada, tek leke kontrolü için ek hücreleri kenara. Bunların dışında kontrollerden tüm kültür antikor kokteyli ile, boyanmış olmalıdır (adım 4.1.1). 6. Leke Hücreler Oda sıcaklığında 30 dakika için arzu edilen florokrom-eşlenik bir antikor kokteylinin ihtiva eden yıkama tamponu 100 uL Leke hücreleri, ışıktan koruyarak. NOT: kokteyl T hücre spesifik ve APC spesifik antikorları içerir. Fluorokromun bunlar görüntüleme konfigürasyonu akış sitometresi kullanılarak ayırt edilebilir şekilde seçilmelidir. t iseBurada gösterilen o deneyler, mavi florofor konjuge CD11b ve APC-konjuge CD90.2 (5 ug / mL) kullanılmıştır (5 ug / mL, Malzemelerin Tablo). x g 400 ° C'de 5 dakika boyunca yıkama tamponu ve santrifüj 1 mL hücreleri yıkayın. Üstte kalan. 0.05-0.5 ug / mL falloidin FITC içeren perma-yıkama tamponunda hücrelerin yeniden askıya ve ışıktan korunarak oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. Not: yaklaşık 0.1 ug / mL Phalloidın FITC konsantrasyonları fare hücreleri için iyi çalışabilir, ancak uygun konsantrasyonu ile ilgili olarak, hücre türüne göre değişir ve görüntüleme akış sitometresi beklenmektedir. 400 x g, 5 dakika boyunca kurutma / yıkama tamponu ve santrifüj 1 mL hücreleri yıkayın. Üstte kalan. Uygun konsantrasyonda nükleer boya (örneğin, yaklaşık olarak 25 ug / ml 7-AAD) içeren perma / yıkama tamponunda hücrelerin yeniden askıya ve ışıktan korunarak oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir. hücreyi yıkayın400 x g, 5 dakika boyunca kurutma / yıkama tamponu ve santrifüj 1 mL s. Üstte kalan. Yıkama tamponu, pelet bir kez hücreler yıkanır ve 50 yeniden askıya – küçük, kapaklı mikrosantrifüj tüplerine hücrelerinin transferi, yıkama tamponu 100 uL. Hemen veri toplamaya kadar devam veya akış sitometresi önce görüntülemede devir birkaç güne kadar ışıktan korumalı 4 ° C 'de hücreler saklayın. NOT: Hücreler başarıyla en fazla 7 gün boyunca bu şekilde depolanmıştır. Daha uzun depolama mümkün olabilir ancak test edilmemiştir. 7. Edinme Veri Başlat ve üreticinin talimatlarına göre sitometresinin görüntüleme akışını yapılandırın. önceki herhangi bir veri toplama akış çekirdek stabilitesini sağlamak. Aydınlık görüntü elde etmek için bir kanal ayırın. aydınlık kanalı kapalı tek-leke kontrol verilerini elde edin. "Yük" düğmesini ve INSE tıklayınTam lekeli numune tutucu içine (gerekli tüm florokromlar ile boyanmış bir numune) ihtiva eden bir tüp, oda sıcaklığına. "Çalışma" penceresinde, ve en-boy oranı, yakın olduğu 1. (yatay eksende kanalın yoğunluk) kullanılan her bir kanal için yeni bir dağılım grafiğini oluşturmak için alan ve kapı tekli fazla en boy oranına sahip yeni bir dağılım grafiğini oluşturmak . her florokrom için, pozitif nüfusu kontrol etmek ve gerekirse, "Tezhip" kutusuna lazer voltajını ayarlayın. tüp boşaltın ve birinci tek lekeli tüp yükleyin. "Toplama Ayarlar" kutusunda, örnek adını yazın ve toplanmalıdır olayların sayısını ayarlamak; Bu (dengeleme kontrol için), tek bir leke ise, 1,000 – 2,000 etkinlik yeterlidir. "Kanallar" kutusunda, her numune ile boyanmış olan kanalları seçin. Tek leke kontroller için, tüm kanallar brightf ile seçilmelidirield ve yan saçılma kapatır. "Toplama" kutusunun altında "Kayıt" düğmesine tıklayın; olay sayısı belirtilen eşiğe ulaştığında, edinim otomatik olarak duracaktır. tüp boşaltmaya "Dönüş" butonuna tıklayın. her bir leke kontrolü için 7.2.6 – Tekrar 7.2.4 adımları tekrarlayın. Sitometresinde ve yazılıma bağlı olarak, satın alma sırasında Şekil 1 'de gösterilen kapılarının her ayarlamak mümkün olmayabilir (daha kesin yolluk analizi sırasında gerçekleştirilir; bölüm 8). (Adım 7.2'de), tek-lekeli örnekleri gibi örnekleri Edinme, ancak "kanallar" kutusunda, aydınlık kanalı içeren gereken tüm kanallar seçmek. veri kaydından önce, kanal yoğunluğu arzu edilen hücre popülasyonları tanımlamak için uygun olduğunu teyit etmek için kontrol edin. Eğer değilse aşama 7.2'de tarif edildiği gibi, yeni ayarları kullanarak lazer ayarları ve yeniden kayıt tek bir leke kontrolleri ayarlayın. Her biri içinNumune, onlarca olaylar binlerce edinirler. Not: Çoğu durumda, hücre-hücre temas olaylar toplam hücre sayısı (en tek hücreler) küçük bir azınlık. Genel olarak, son membran temas kapısı olarak en az 100 etkinlik arzu edilir. 8. Veri Analiz Üreticinin web sitesinden ücretsiz olarak analitik yazılımı mevcut kullanarak sitometresinin görüntüleme akışına edinilen verileri analiz (Bir kullanıcı hesabı oluşturulması gerekir; Malzemelerin Tabloya bakınız). Şekil 1. Yolluk Strateji alloreaktiftir Bağışıklık sinaps tanımlamak için kullanılır. Olaylar kökü dayalı hücre görüntüleri inceleyerek tüm olaylardan kapılı Odakta A. aydınlık chan kullanarak görüntü yoğunluk profili (Gradyan RMS) değişim hızına kareler ortalamasınel (kanal 4, Ch04), metinde anlatıldığı gibi. B. odak olaylar arasında, ikili aydınlık kanal için alanına kıyasla boy oranı çizilerek tek hücrelerden ayırt edilir. çiftli 0.5 yakın olan ve daha büyük bir alana sahip ise tek hücreler, 1'e yakın en-boy oranına kümelenmiş ve daha küçük bir alanı vardır. C. APC florasan yoğunluğu (bu durumda, bir dendritik hücre [DC] işaretleyici, CD11c) daha sonra T-hücresi markeri floresan yoğunluğu (bu durumda, CD90.2) grafiği çizilir ve çift pozitif olaylar kapılı. Kapının sınırları sınırlarına yakın olayların görüntülerini inceleyerek rafine edilebilir. Bunlar APC işaretleyici (CD11c, CH02) bölgesinde karşılık boy oranı çizilerek tek APC içeren, böylece D. A-APC ikili daha sonra rafine edilir. Bunlar alanına kıyasla boy oranı çizilerek tek T hücresi içereceği şekilde, E. Bu tek-APC ikili daha sonra rafineT hücre işaretçisi (CD90.2, Ch06). F. Sonuç olarak, sadece iki çekirdek içeren olaylar sadece 2 7-AAD pozitif noktalar (yani, çekirdekler) içeren olayların bir nükleer boya kanal (7-AAD, Ch05) nokta sayısı bir histogram çizilmesi ve yolluk seçilir. Şekil 2'de tarif edildiği gibi, bu kapı olaylar, membran temas ve sinaps oluşumu için analiz edilmiştir. Veri işleme atama göre körleme olarak analiz edilmiş ve önceden yayınlanmış bir deneyde 23 içerikleri arasında. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın. NOT: yolluk strateji bu bölümde anlatılan ve Şekil 1 'de tasvir edilmiştir. veri sitometrisi görüntüleme akış analizi, işlem değerlendirmelerinde birbirlerini göre bir kör bir şekilde yapılmalıdır. Biz bağışıklık sinaps dışı synapti inanıyoruz rağmenc temas genel olarak kolaylıkla ayırt (aşağıya bakın ve Şekil 2 ve 3), kör görüntü analizi özgü öznelliğinden kaynaklanan verevi en aza indirmek gerekir edilir. dengeleme sihirbazı içine tek bir leke kontrol veri dosyaları yükleyerek bir dengeleme matrisi oluşturur. Tek lekeli sonra dosya yükleme deneyde kullanılan floresan kanalları seçmek. NOT: yazılım otomatik bir dengeleme matrisi oluşturur, ancak bu el ile doğru pozitif popülasyonları seçildi sağlamak için kontrol edilmelidir. matris içinde bir değeri çift tıklayarak analiz alanına grafik ekleyin. ölü hücreler / çiftli / yanlış pozitif dışlamak için gerekiyorsa yeni bir kapı oluşturun; Bu yeni rafine olumlu nüfus her kanal için açılan menüde matris kutusunda seçilebilir. Her bir kanal için bu işlemi tekrar edin. compensatio kaydetmek için "Son" ClickN matrisi (.ctm dosyası). analiz yazılımı .rif dosya yükleme ve dengeleme matrisi uygulanarak ham dosyası (.rif) gelen bir veri analiz dosyası (.daf) elde edilir. Veri yüklendikten sonra, T hücre-APC temas olayları tanımlamak için yolluk gerçekleştirin. Not: Tipik bir geçit stratejisi odak olayları tanımlamak içerir, boyut kriterler (olayın en boy oranına karşı alan) ve temel çiftleri seçilmesi T-hücresi için Çift pozitif olan olaylar T hücre-APC çiftleri seçme ve APC işaretleyicileri (Şekil 1A-C). Not: boy oranı tek hücre ayrımı çifti arasından (1 oran yakın) (0.5 oranı kapat) izin veren bir yüksekliğe, bir olay, genişliği oranıdır. Kök aydınlık kanalı (Şekil 1A) görüntüleme yoğunluk profili (gradyan RMS) değişim hızının ortalama kare çizilerek odaklanmış olayları tanımlamak. th tıklayınE gradyan RMS histogram bireysel kutularına hücre olayları görüntülemek ve sonra dışarı odak-olaylarını hariç bir kapı yerleştirmek. Aydınlık kanalının boy oranına karşı alanı Konu ve olay şekli ve büyüklüğü (Şekil 1B) göre ikilileri tanımlayan bir kapı çizin. Sadece içinde ve bu kapının sınırın dışında olanları görüntülerin Gözden geçidin boyutu ve konumu rafine analisti yardımcı olabilir. Daha sonra, T hücre markeri yoğunluğu bir eksen üzerinde görüntülenir, ve APC işaretleyici yoğunluğu diğer göründüğü bu ikili etkinlikleri eğrisinin oluşturulması. Her ikisinin de işaretleyicilerin pozitif olaylar ihtiva eden bir T-APC çiftli kapı çizin. T hücre APC çiftli olaylar sadece bir T hücresi ve bir APC içerirler seçeneğini olaylar arasında. APC marker için alanına kıyasla boy oranı çizilerek ve tek bir APC (Şekil 1D) ihtiva eden çiftli toplanması ile yapın. T-hücresi işareti alanına kıyasla boy oranı KonuTek bir T hücresi (Şekil 1 E) ihtiva eden çiftli ER ve kapı. NOT: Diğer arıtma iki noktalar (Şekil 1F) ile olayları bir nükleer boya floresans ve yolluk uygulanan bir nokta sayısı fonksiyonu bir histogram çizilerek elde edilebilir. Bazı durumlarda, bir dublet içinde iki hücre temas halinde olmayacak; Birbiri ile temas halinde hücreleri belirlemek APC 've T hücreleri için bir amacı maskeleri tanımlamak için kullanılır. Maskeler yöneticisini açmak ve yeni bir maske tanımlamak için Analiz menüsünde "Maskeler" seçeneğini kullanın. gibi bir ad yazın "T-hücresi nesne maske." "İşlev" butonuna tıklayın ve iletişim kutusunda, seçim "nesnesi." T hücre markeri tespit edildiği kanalı (örneğin, Ch06) seçin. "Tamam" ı tıklayın. NOT: "Nesne (Sıkı M06, Ch06)" İşlev kutusunda görüntülenir. Bu varsayılan nesne maske genellikle kelİyi ks ancak optimizasyon gerektirebilir. Uygun kanalda bir APC nesnesi maskesi oluşturmak için bu işlemi tekrar edin. APC ve T-hücresi maskeleri belirledikten sonra, T-hücresi nesne maske APC floresan yoğunluğu karşı APC nesne maske T hücre markeri floresans yoğunluğunu çizilerek zarlar belirler. Bu arsa üzerinde, birbirleri ile temas halinde sadece hücreleri içeren bir kapı çizin. Not: Genellikle, oldukça net bir çift pozitif ve çift negatif popülasyonu (Şekil 2A) bulunmaktadır. Çift pozitif ve çift negatif popülasyonlar arasındaki sınır temas halinde hücreler Geçitte değil temas halinde hücreler hariç tutulmasını olmasını sağlamak için sınır bölgesindeki hücrelerin aydınlık görüntüleri inceleyerek ayarlanabilir. Bu aşamada, elle basit hücre-hücre temas olgun bağışıklık sinaps ayırt etmek bu kapının içindeki olayların faloidin FITC görüntülerini inceleyin. UBu görüntüleri işaretlemek için "etiket görüntüleri" işlevini se. NOT: Bu kapıdan içeri etiketli olayların (bağışıklık sinaps) yüzdesi T hücre popülasyonunda doğrudan alo bir göstergesi olarak kullanılabilir çalışılmaktadır.

Representative Results

Bu yöntem, heterotopik kalp alograft transplantasyon öncesi verici alloantijenlere karşı toleranslı hale getirilmiş farelerde CD4 + T-hücresi alloreaktivitesini araştırmak için kullanıldı. CBA fareleri (H-2k) (, H-2b, B6) bir-tüketici olmayan CD4 antikoru, bir ay ile bir araya kan nakli öncesinde B6 kalp nakli için bir verici-spesifik oluşan bir tolerans kuralı verildi. Foxp3 + regülatör T hücreleri 36, 37 bağlıdır, uzun vadeli alograft ömrünü Bu protokol ile sonuçlanır. Tolerize ve B6, kardiyak allogreftlerin tolerize olmamış alıcılar ve birlikte kuluçkaya Bu protokole göre B6, kemik iliğinden türetilmiş DCler ile olan post-transplant yedi gün, dalak CD4 + T hücreleri elde edildi. Şekil 2, bu deneyden elde edilen temsili verileri gösterir. Membran temas kapısı, Şekil 2 'de gösterilmiştirBir yeşil ince artı bir sinaptik olay üzerine yerleştirilen ile (Sol panel, 1) ve olmayan bir sinaptik olayı (sağ panel). Şekil 2B, bu etkinlik için aydınlık ve floresan kanallarını göstermektedir. Önyargı azaltmak için, veri işleme ataması 23 körleşmiş bir gözlemci tarafından analiz edildi. Her iki tolerize olmamış, Şekil 3'te çeşitli örneklerde gösterildiği gibi (Şekil 3A-B) ve tolerize (Şekil 3C-D), B6 kalpler CBA alıcıları, sinaps T APC ara yüzeyinde yoğun bir FITC pozitif sırt varlığıyla olmayan, sinaptik temasların kolayca ayırt edilir. Bu sonuçlar, alıcı T hücreleri tarafından yapılan bağışıklık sinaps görsel saptama alıcısında alo-tepkiselliği derecesi ile izler göstermektedir. Membran T-APC ikilileri Şekil 2. Kimlikİletişim ve Bağışıklık Synapse oluşumu. Nihai çift kapı (Şekil 1F) olaylar analiz edilir. APC nesne maske A. T hücre markeri floresan DC nesne maske APC markör floresan karşı çizilmiştir. Bazı çiftler olaylar hücre-hücre temas olmadan bir APC, ve T hücresi varsa ve arsa sol alt köşesinde görüntülenir (resimler gösterilmemiştir). Bir membran temas kapısı bu yüzden T hücreleri ve APC 'ler temas halinde olduğu, yalnızca çiftleri içeren çizilebilir. bu kapının her olayın görüntüleri faloidin-FITC kanalında aktin hücre iskeleti yeniden düzenlenmesi kanıtı incelenir ve analiz yazılımı kullanılarak etiketlenebilir. Sol panel Sağ panel bağışıklık sinaps oluşumu olmadan bir membran temas etkinliği gösterir ise, bir immün sinaps olay (1 etiketli ve yeşil kursör ile gösterilir) gösterir (2 etiketli ve yeşil kursör ile gösterilir). sinaps oluşumu belirlenmesi Bunların manuel inceleme gerektirirgörüntü, B.B. gösterilen üst satır bir bağışıklık sinaps ile, ikili için aydınlık ve floresan kanal görüntülerini gösterir (A durumunda 1 karşılık gelir); alt sıra membran temas ama eksik sinaps oluşumu (A durumunda 2 tekabül eder) ile bir ikili gösterir. Veri işleme atama göre körleme olarak analiz edilmiş ve önceden yayınlanmış bir deneyde 23 içerikleri arasında. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın. T-APC Sinaps formasyonunun Şekil 3. Örnek. CBA farenin (ya da herhangi bir ön-muamele (AB) 'den veya bir-tüketici olmayan anti-CD4 antikorunun örtüsü altında B6 tam kan ile tolerans sonra B6 vericilerden kardiyak allograftlar alınan <st Rong> CD). 7 gün sonra, dalak CD4 + T hücreleri, B6 DCler ile sinaps oluşumu için test edildi. C. olmayan bir tolerize edilmiş hayvandan membran temas olmayan sinaptik çifti üç örnek. B. olmayan bir tolerize edilmiş hayvandan bağışıklık sinaps üç örnek. C. tolerize edilmiş hayvandan membran temas olmayan sinaptik çifti üç örnek. D. tolerize edilmiş hayvandan bağışıklık sinaps üç örnek. Sinaps oluşumu, T-APC arabirimi (Ch03) parlak bir FITC pozitif sırt varlığı ile gösterilir. Veri işleme atama göre körleme olarak analiz edilmiş ve önceden yayınlanmış bir deneyde 23 içerikleri arasında. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın. ays "> Antikor / Boya florokrom Kanal konsantrasyon CD11c eF450 CH02 5 ug / mL, deneysel olarak titre CD90.2 APC Ch06 5 ug / mL, deneysel olarak titre Phalloidın FITC Ch03 0,05-0,5 ug / ml 7-AAD – Ch05 25 ug / ml Tablo 1. Antikorlar ve bu Çalışmada Kullanılan Boyalar. Florokrom-eşlenik antikorlar, boyalar, tedarikçi ve tavsiye edilen konsantrasyonlarda tabloda sunulmaktadır. Her bir florokrom tespit etmek için kullanılan kanal sitometresi görüntüleme akışı da tabloda gösterilmiştir.

Discussion

Görüntüleme akış sitometrisi monoklonal T hücreleri ve APC 'ler arasında veya süper antijenler 24, 25, 26, 27, 28 varlığı, immün sinaps oluşumunu göstermek için kullanılmıştır. Bu yöntem, verimli bir T hücre-APC temas ettikten sonra, T hücre teması 21 yerinde doğru polarize olarak, aktin hücre iskeleti yeniden düzenler olmasından yararlanır. Bu yeniden düzenlenme TCR sinyali olmaksızın oluşmaz, ve bu nedenle, T-hücresi aktivasyonu 19, 20, 21 erken bağıntısı olduğunu gösterdi. Burada sunulan yöntem poliklonal T hücre popülasyonlarında alloreaktif T-hücresi frekans ölçümü için bu yaklaşım adapte olur. Bunun gibi, gelecekte donör reactivi için tahliller gelişmesi için temel teşkil edebilir Klinik naklinde Ty.

doğrudan karşılaştırmalar henüz yapılmamış olmasına rağmen, alloreaktiftir bağışıklık sinapsların algılama geleneksel MLR'den daha üstün öngörü gücüne sahip görünmektedir. Tolerans yukarıda tarif edilen protokol, örneğin, önceki eser göstermiştir, bir MLR sonuçları güvenilir bir aşı sonucu 2 ile ilişkili başarısız.

Bu alloantijen yanıt olarak, efektör hücre fonksiyonu ölçmek her ne kadar bir çok deney, insan 9, 10, 11 işlevsel olarak dayanıklı durum için geliştirilmiştir. Bunun aksine, IFNy ELISPOT 8 ölçü efektör T-hücresi fonksiyonunu deneyleri, ancak, IL-17 38 gibi akut ve kronik allogreft reddi ile ilgili olabilir, sitokin salgılanması tam spektrum, yakalamak değildir,> 39. Emek yoğun bir şekilde sınırlandırıcı bir sulandırma deney 4, ve fareler gerektirir trans-vivo deney, 6, klinik bir ortamda kendi uygulama engelleyecek önemli pratik sınırlamaları vardır. MLR'de yanıt T hücrelerinin TCR dizi analizi kullanılarak çoğalan hücrelerin analizi son gelişmeler değer olabilir, fakat burada sunulan deney gibi, klinik çalışmalarda 18 40 ayrıca doğrulama gerektirecektir.

Bağışıklık sinaps saptama deneyinin daha da geliştirilmesi önemli bir dizi soru cevap edilmesini gerektirecektir. İlk olarak, geliştirilmiş olarak tahlil sadece doğrudan alloreaktivitesini ölçer. doğrudan yol verici türetilmiş APC'ler Allojenik MHC / peptid komplekslerinin tanıtımı içerir. ikincisi genellikle hızlı bir şekilde nakli sonrası elimine ve ayrıca alloantijeni sunum Carri olan edilirsağlam verici MHC (yarı doğrudan bir güzergahın) ortaya alıcı APC veya kendi MHC molekülleri (dolaylı yol) işlenmiş verici antijenleri tarafından ed. Dolaylı yol kronik allograft reddi 33, 41 arasında önemli bir sürücüdür.

Prensip olarak, tahlil kullanılarak dolaylı bağışıklık sinaps tespit etmek mümkün olmalıdır, ancak dolaylı alloreaktiftir T hücreleri olayların daha çok sayıda analizi gerekecektir, yani direkt olanları 42, 43 çok daha düşük frekansa sahiptir. İkinci bir husus sadece CD8 + T hücreleri aynı zamanda anti-verici tepkisinin önemli bir bileşeni, oysa, CD4 + T hücreleri kullanılarak, bu tahlil test olmasıdır. Yine, yöntem kullanılarak CD8 + T hücre-APC sinaps tespit etmek mümkün olmalıdır. Başka bir sınırlama yöntemi nihai memb manuel inceleme ve hücre görüntülerinin analizini gerektirirrane iletişim kapısı ve şu anda bu adımın otomasyon üzerinde çalışıyoruz.

Son olarak, bu yöntem, insan deneklerde test ve geliştirilmesini gerektirmektedir ve insan örnekleriyle ön çalışmalar halen yapılmaktadır. Transplant alıcılarında immün sinaps tespiti ile kombinasyon halinde daha fazla fenotipik T-hücresi alt tiplerinin (örneğin, efektör, bellek, düzenleyici, vs.) alloreaktif T-hücresi repertuarını karakterize etmek için güçlü bir yaklaşım ifade eder ve önemli bir odak noktası olacaktır gelecek iş.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

SCJ bir Uluslararası Kalp Derneği ve Akciğer Nakli Araştırma Bursu ve doktorlar hangi Royal College ve Fellowship.SM Seyahat Kanada Detweiler ait Cerrahlar tarafından desteklendi Kalp ve (SKB'nin kadar) Akciğer Transplantasyonu Kariyer Geliştirme Ödülü için uluslararası bir Society tarafından kısmen desteklenmiştir. SS Sağlık Araştırma Oxford Biyomedikal Araştırma Centre.JH Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir bir Böbrek Araştırma UK Kıdemli Olmayan Klinik Bursu almıştır. Bir Wellcome Trust Programı Grant (082519Z07Z), bir İngiliz Kalp Vakfı Programı Grant (PG / 10 / 62,28504) ve AB Çerçeve Programı 7 (; BioDRIM BİR Çalışması): Bu çalışma AB ve kw aşağıdaki bağışları ile finanse edilmiştir. Yazarlar ImageStream Mark X aletle erişimi ve destek sağlamak için Michael Parsons ve Lunenfeld-Tanenbaum Araştırma Enstitüsü'nde Sitometrisi Çekirdek Tesisi, Sina Sağlık Sistemi, Toronto teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Phosphate-buffered saline Various Varies
Ethylenediamenetetraacetic acid, 0.5M solution Thermo Fisher Scientific AM9260G
Triton X-100 nonionic detergent Sigma-Aldrich X100
Beta-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D8418
Formaldehyde Sigma-Aldrich F1635 Solution is 37% formaldehyde and so must be diluted 25 times for 1.5% solution
Cell strainers, 70 μm pore size Fisher Scientific 08-771-2
Phalloidin-fluorescein isothiocyanate Sigma-Aldrich P5282
7-aminoactinomycin D Thermo Fisher Scientific A1310 Reconstitute in DMSO
Allophycocyanin-conjugated anti-mouse CD90.2 eBioscience 17-0902
Pacific blue-conjugated anti-mouse CD11b eBioscience 48-0112 Pacific blue has been replaced by eFluor 450
Biotinylated anti-mouse CD3 eBioscience 13-0032
Biotinylated anti-mouse MHC class II eBioscience 13-5321
Biotinylated anti-mouse B220 eBioscience 13-0452
Biotinylated anti-mouse CD8 eBioscience 13-0081
Biotinylated anti-mouse CD19 eBioscience 13-0193
Anti-biotin microbeads Miltenyi Biotec 130-090-485
LS columns Miltenyi Biotec 130-042-401
MidiMACS magnetic cell separator MIltenyi Biotec 130-042-302
recombinant mouse GM-CSF Peprotech 315-03
recombinant human TGFβ1 Peprotech 100-21 Human TGFβ1 has activity on mouse cells
Amnis ImageStream X Mark II Amnis/EMD Millipore N/A Imaging flow cytometer; details available at http://www.emdmillipore.com/
IDEAS Software Amnis/EMD Millipore N/A Free download (registration required): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20
Cell culture medium  Various Varies
Fetal bovine serum Various Varies
Cell culture plates Various Varies
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cravedi, P., Heeger, P. S. Immunologic monitoring in transplantation revisited. Curr Opin Organ Transplant. 17 (1), 26-32 (2012).
  2. Pearson, T. C., et al. The assessment of transplantation tolerance induced by anti-CD4 monoclonal antibody in the murine model. Transplantation. 55 (2), 361-367 (1993).
  3. Strober, S., Benike, C., Krishnaswamy, S., Engleman, E. G., Grumet, F. C. Clinical transplantation tolerance twelve years after prospective withdrawal of immunosuppressive drugs: studies of chimerism and anti-donor reactivity. Transplantation. 69 (8), 1549-1554 (2000).
  4. Fussell, S. T., Donnellan, M., Cooley, M. A., Farrell, C. Cytotoxic T lymphocyte precursor frequency does not correlate with either the incidence or severity of graft-versus-host disease after matched unrelated donor bone marrow transplantation. Transplantation. 57 (5), 673-676 (1994).
  5. Roelen, D. L., et al. Relevance of cytotoxic alloreactivity under different immunosuppressive regimens in clinical islet cell transplantation. Clin Exp Immunol. 156 (1), 141-148 (2009).
  6. VanBuskirk, A. M., et al. Human allograft acceptance is associated with immune regulation. J Clin Invest. 106 (1), 145-155 (2000).
  7. Poggio, E. D., Clemente, M., Hricik, D. E., Heeger, P. S. Panel of reactive T cells as a measurement of primed cellular alloimmunity in kidney transplant candidates. J Am Soc Nephrol. 17 (2), 564-572 (2006).
  8. Zitzner, J. R., Tambur, A. R. Role of ELISPOT Assays in Risk Assessment Pre- and Post-Kidney Transplantation. Cells. 1 (2), 100-110 (2012).
  9. Newell, K. A., et al. Identification of a B cell signature associated with renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1836-1847 (2010).
  10. Brouard, S., et al. Identification of a peripheral blood transcriptional biomarker panel associated with operational renal allograft tolerance. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (39), 15448-15453 (2007).
  11. Sagoo, P., et al. Development of a cross-platform biomarker signature to detect renal transplant tolerance in humans. J Clin Invest. 120 (6), 1848-1861 (2010).
  12. Halloran, P. F., Famulski, K. S., Reeve, J. Molecular assessment of disease states in kidney transplant biopsy samples. Nat Rev Nephrol. 12 (9), 534-548 (2016).
  13. Li, L., et al. Identification of common blood gene signatures for the diagnosis of renal and cardiac acute allograft rejection. PLoS One. 8 (12), e82153 (2013).
  14. Khatri, P., et al. A common rejection module (CRM) for acute rejection across multiple organs identifies novel therapeutics for organ transplantation. J Exp Med. 210 (11), 2205-2221 (2013).
  15. Halloran, P. F., et al. Microarray diagnosis of antibody-mediated rejection in kidney transplant biopsies: an international prospective study (INTERCOM). Am J Transplant. 13 (11), 2865-2874 (2013).
  16. Mastoridis, S., Issa, F., Wood, K. J. Novel biomarkers and functional assays to monitor cell-therapy-induced tolerance in organ transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 20 (1), 64-71 (2015).
  17. Miqueu, P., et al. Analysis of the peripheral T-cell repertoire in kidney transplant patients. Eur J Immunol. 40 (11), 3280-3290 (2010).
  18. Morris, H., et al. Tracking donor-reactive T cells: Evidence for clonal deletion in tolerant kidney transplant patients. Sci Transl Med. 7 (272), 272ra210 (2015).
  19. Dustin, M. L., Bromley, S. K., Kan, Z., Peterson, D. A., Unanue, E. R. Antigen receptor engagement delivers a stop signal to migrating T lymphocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (8), 3909-3913 (1997).
  20. Goldsmith, M. A., Weiss, A. Early signal transduction by the antigen receptor without commitment to T cell activation. Science. 240 (4855), 1029-1031 (1988).
  21. Grakoui, A., et al. The immunological synapse: a molecular machine controlling T cell activation. Science. 285 (5425), 221-227 (1999).
  22. Stoll, S., Delon, J., Brotz, T. M., Germain, R. N. Dynamic imaging of T cell-dendritic cell interactions in lymph nodes. Science. 296 (5574), 1873-1876 (2002).
  23. Juvet, S. C., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. Quantification of CD4(+) T Cell Alloreactivity and Its Control by Regulatory T Cells Using Time-Lapse Microscopy and Immune Synapse Detection. Am J Transplant. 16 (5), 1394-1407 (2016).
  24. Ahmed, F., Friend, S., George, T. C., Barteneva, N., Lieberman, J. Numbers matter: quantitative and dynamic analysis of the formation of an immunological synapse using imaging flow cytometry. J Immunol Methods. 347 (1-2), 79-86 (2009).
  25. Burbach, B. J., et al. Distinct regulation of integrin-dependent T cell conjugate formation and NF-kappa B activation by the adapter protein ADAP. J Immunol. 181 (7), 4840-4851 (2008).
  26. Markey, K. A., et al. Cross-dressing by donor dendritic cells after allogeneic bone marrow transplantation contributes to formation of the immunological synapse and maximizes responses to indirectly presented antigen. J Immunol. 192 (11), 5426-5433 (2014).
  27. Moreau, H. D., et al. Dynamic in situ cytometry uncovers T cell receptor signaling during immunological synapses and kinapses in vivo. Immunity. 37 (2), 351-363 (2012).
  28. Wabnitz, G. H., Nessmann, A., Kirchgessner, H., Samstag, Y. InFlow microscopy of human leukocytes: A tool for quantitative analysis of actin rearrangements in the immune synapse. J Immunol Methods. , (2015).
  29. Ford, W. L., Simmonds, S. J., Atkins, R. C. Early cellular events in a systemic graft-vs.-host reaction. II. Autoradiographic estimates of the frequency of donor lymphocytes which respond to each Ag-B-determined antigenic complex. J Exp Med. 141 (3), 681-696 (1975).
  30. Macedo, C., et al. Contribution of naive and memory T-cell populations to the human alloimmune response. Am J Transplant. 9 (9), 2057-2066 (2009).
  31. Noorchashm, H., et al. A direct method for the calculation of alloreactive CD4+ T cell precursor frequency. Transplantation. 67 (9), 1281-1284 (1999).
  32. Suchin, E. J., et al. Quantifying the frequency of alloreactive T cells in vivo: new answers to an old question. J Immunol. 166 (2), 973-981 (2001).
  33. Lee, R. S., et al. Indirect recognition of allopeptides promotes the development of cardiac allograft vasculopathy. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (6), 3276-3281 (2001).
  34. Pickl, W. F., et al. Molecular and functional characteristics of dendritic cells generated from highly purified CD14+ peripheral blood monocytes. J Immunol. 157 (9), 3850-3859 (1996).
  35. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176 (6), 1693-1702 (1992).
  36. Francis, R. S., et al. Induction of transplantation tolerance converts potential effector T cells into graft-protective regulatory T cells. Eur J Immunol. 41 (3), 726-738 (2011).
  37. Saitovitch, D., Bushell, A., Mabbs, D. W., Morris, P. J., Wood, K. J. Kinetics of induction of transplantation tolerance with a nondepleting anti-Cd4 monoclonal antibody and donor-specific transfusion before transplantation. A critical period of time is required for development of immunological unresponsiveness. Transplantation. 61 (11), 1642-1647 (1996).
  38. Faust, S. M., et al. Role of T cell TGFbeta signaling and IL-17 in allograft acceptance and fibrosis associated with chronic rejection. J Immunol. 183 (11), 7297-7306 (2009).
  39. Yuan, X., et al. A novel role of CD4 Th17 cells in mediating cardiac allograft rejection and vasculopathy. J Exp Med. 205 (13), 3133-3144 (2008).
  40. Emerson, R. O., Mathew, J. M., Konieczna, I. M., Robins, H. S., Leventhal, J. R. Defining the alloreactive T cell repertoire using high-throughput sequencing of mixed lymphocyte reaction culture. PLoS One. 9 (11), e111943 (2014).
  41. Stanford, R. E., Ahmed, S., Hodson, M., Banner, N. R., Rose, M. L. A role for indirect allorecognition in lung transplant recipients with obliterative bronchiolitis. Am J Transplant. 3 (6), 736-742 (2003).
  42. Benichou, G., Valujskikh, A., Heeger, P. S. Contributions of direct and indirect T cell alloreactivity during allograft rejection in mice. J Immunol. 162 (1), 352-358 (1999).
  43. Liu, Z., et al. Contribution of direct and indirect recognition pathways to T cell alloreactivity. J Exp Med. 177 (6), 1643-1650 (1993).

Tags

T Cell AlloreactivityImaging Flow CytometryTransplant ImmunologyDendritic CellsT CellsCell-cell InteractionsFluorescent MicroscopyFlow CytometryCell CultureFixationStainingPerm/wash BufferNuclear DyeBrightfield Imaging

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Juvet, S. C., Moshkelgosha, S., Sanderson, S., Hester, J., Wood, K. J., Bushell, A. Measurement of T Cell Alloreactivity Using Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (122), e55283, doi:10.3791/55283 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image