Systeem voor de werkzaamheid en cytotoxiciteit Screening van inhibitoren voor intracellulaire<em> Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, de verwekker van tuberculose (TB), is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Geneesmiddel- gevoelige TB is een behandelbare ziekte die meerdere antibiotica gedurende 6 maanden vereist. Ondanks dat het een behandelbare ziekte, werd TB sterfte geschat op 1,5 miljoen in 2015 ^1. In de afgelopen 10 jaar zijn er zijn toenemende bezorgdheid over de prevalentie van resistente M. tuberculosis. Multiresistente tuberculose (MDR-TB) wordt gedefinieerd als tuberculose die resistent is tegen ten minste isoniazide (INH) en rifampicine (RMP), en de meeste MDR-TB-stammen zijn ook bestand tegen tweedelijns tbc selecteren, dus beperkt behandelingsmogelijkheden . De effecten van geneesmiddelresistentie maken een grotere uitdaging voor de behandeling van patiënten die geïnfecteerd zijn met humaan immunodeficiëntievirus (HIV); 400.000 patiënten wereldwijd overleden aan HIV-geassocieerde TB in 2015 ^1. Teleurstellend, de Amerikaanse Food and Drug Administrantsoen heeft goedgekeurd slechts één nieuwe TB-geneesmiddelen tegen MDR-TB, Bedaquiline, in de afgelopen 40 jaar ^2. Vooruitgang in het vinden van betere en kortere TB therapieën zijn dringend nodig om voorop te blijven in de strijd tegen tbc en MDR-TB.

Traditioneel worden TB drug screens uitgevoerd onder in vitro kweekomstandigheden in groeimedium, waarbij verbindingen worden toegevoegd aan een groeiende kweek en hun doeltreffendheid bij het uitroeien van de micro-organismen wordt bepaald door het tellen van kolonievormende eenheden (CFU) op vast medium. Zoals CFU tellingen zijn arbeidsintensief, tijdrovend en kostbaar zijn verschillende indirecte methoden ontwikkeld om dit probleem te verlichten. Dergelijke werkwijzen omvatten de Alamar Blue assay levensvatbaarheid ^3, de bepaling van fluorescentie ⁴ van groen fluorescent eiwit (GFP) of luminescentie ⁵ van luciferase-expressie bacteriën, en de schatting van de totale adenosine trifosfaat (ATP) ^{6, 7.}

Typische TB wordt gekenmerkt door een M. tuberculosis-infectie van de longen, waar de bacteriën bevinden en repliceren in de phagosomes van alveolaire macrofagen ^8. De eenvoudige bouillon fenotypische scherm kan extracellulaire pathogenen te passen; Echter, in het historisch perspectief, sloeg verbindingen tegen M. tuberculosis geïdentificeerd met behulp van deze methode vaak niet om te voldoen aan de verwachtingen tijdens downstream validatie stappen in modellen van infectie. Wij stellen voor dat TB drug wordt het best uitgevoerd in een intracellulaire gastheercel infectie model. Toch intracellulaire modellen beschikken over een groot aantal technologische en biologische barrières voor high-throughput screening (HTS) ontwikkeling. Een grote hindernis is de complexiteit van het infectieproces, geïllustreerd door tal van stappen en de uitgebreide verwijdering van extracellulaire bacteriën door middel van in-tussen wassen. Een tweede belangrijke horde is de lange tijd aan het opnieuwquirements, de groei detectie Gewoonlijk wordt hierbij CFU rekenen op kweekplaten, is een proces dat meer dan 3 weken in beslag neemt. Een oplossing voor CFU tellingen vervangen is door geautomatiseerde fluorescentie microscopie in combinatie met fluorescerende bacteriën. Echter, deze oplossing vereist een initiële investering in apparatuur die buiten het bereik van vele onderzoekslaboratoria. Een eenvoudige, goedkope en ziekte-relevante HTS methode zou sterk verbeteren het geneesmiddel ontdekkingsproces.

In deze studie rapporteren we een nieuwe, modulaire HTS systeem dat is gericht op een snelle en zeer schaalbaar, zuinige, assay voor de bepaling van de activiteit van verbindingen tegen intracellulaire M. tuberculosis. Dit systeem bestaat uit drie modules: (i) intracellulair, (ii) cytotoxiciteit en (iii) in bouillon assays. De gecombineerde eindresultaat geeft een uitgebreide beschrijving van de verbinding eigenschappen, aanvullende informatie over de mogelijke werkingsmechanismen. dit screening systeem is gebruikt in verscheidene projecten verschillende samengestelde bibliotheken die werkingsmechanisme targeten, waaronder de analyse van geneesmiddel synergie ^9, de stimulering van autofagie ^10, en de remming van M. tuberculosis -secreted virulentiefactor (ongepubliceerd). Verbindingen van onbekende werkingsmechanisme hebben ook onderzocht ^11. Een aangepaste versie van deze methode werd ook door onze industriële partner aangenomen als de primaire screening methode om nieuwe verbindingen te identificeren tegen intracellulaire M. tuberculosis ^11.