세포 내 염색 및 유동 세포 계측법은 고혈압의 모델에 쥐 대동맥, 신장 및 림프절에서 림프구 하위 집합을 식별하는
Summary
이 문서에서는 식별하고 세포 내 염색에 의해 쥐의 신장, 대동맥 림프절 내에 존재하는 기능 T 림프구의 하위 집합을 정량화 및 유동 세포 계측법하는 자세한 방법을 제공합니다. 안지오텐신 II 유발 된 고혈압의 모델은 설명 단계별, 절차 및 유동 세포 계측법의 기본 원리 및 세포 내 염색하기 위해 선택되었다.
Abstract
It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.
Introduction
최근의 증거는 적응성 면역계, 특히 T 림프구가 여러 1,2,3,4,5 심혈관 질환의 발달에서 중요한 역할을한다는 것을 보여준다. 예를 들어, 안지오텐신 II 고혈압의 모델에서는, 용기 및 마우스의 신장에서 T 세포의 축적이 6을 설명 하였다. 혈관 축적은 외막과 혈관 주위 지방에 주로있다. 신장에서, T 세포는 골수 및 신장 피질 모두에서 축적된다. 관련되는 서브 세트에 따라 이러한 T 세포는 혈관 및 신장 기능에 영향을 병리 현상을 초래할 수있는 다른 사이토킨을 야기 (맥 매스터 등. (6)에 의해 검토).
CD4 + T 헬퍼 림프구 여러 서브 세트들로 분할 될 수있다 : 그 기능 및 서명 사이토에 기초하여 T 헬퍼 1 (받은 Th1), TH2, TH9, Th17, Th22, T 조절 (TREG) 세포 및 T 모낭 헬퍼 (TFH) 세포kines 7. 마찬가지로, CD8 + 세포 독성 T 세포는 T에서, TC2, TC9 Tc17 또는 8로 분류 될 수있다. 합니다 (CD4 또는 CD8 T 세포 마커를 발현하지 않는, 즉 세포) 더블 부정적인 T 세포도 있습니다. 이들 세포의 서브 세트는 다른 감마 델타 T 세포 수용체 (대신 고전 알파 및 베타 수용체)를 갖고, 따라서 감마 델타 T 세포라고 칭한다. 표면 마커, 사이토 카인 및 전사 인자의 유동 세포 계측법에 의한 다 변수 분석은 이들 세포를 식별하기 위해 가장 좋은 방법을 구성한다. 이 방법은 광범위 면역학 분야에서 사용되지만, 그것은 덜 단단한 장기 및 심혈 관계 질환의 설정에 대하여 설명한다.
역사적으로, 조직에 임파구의 식별은 면역 또는 RT-PCR에 방법에 한정되었다. 면역 조직 화학 및 면역 형광은 INT의 항원의 조직 분포를 결정하는 강력한 방법이 있지만erest, 그들은 표현형과 관련된 부분 집합을 식별하는 데 불충분하다. RT-PCR 분석은 항원, 사이토 카인 또는 전사 인자의 mRNA의 발현을 검출하는 데 유용하면서 또한, 그것은 동시에 각각의 세포의 레벨에 여러 단백질의 검출을 허용하지 않는다.
사이토 카인 및 전사 인자를 검출하는 세포 염색 결합 특히 유동 세포의 출현은, 고형 장기 면역 세포 서브 세트의 단일 세포 수준에서의 식별 및 정량화 할 수있는 강력한 방법으로 연구자를 제공한다. 우리는 안지오텐신 II 유발 고혈압 모델 쥐의 신장, 대동맥 및 대동맥 림프절 내에 존재하는 주요 T 세포 하위 집합 유동 세포 계측법에 의해 식별하는 세포 내 염색 분석을 최적화했다. 높은 다시 A의 조직 소화, 생체 활성화, permeabilization, 표면 및 세포 내 염색 결과 : 각 단계의 최적화심혈관 및 신장 질환 모델에 적용 할 수있는 제조 가능한 분석.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described herein has been optimized to properly identify T cell subsets present within murine kidneys, aorta and lymph nodes. This protocol can be easily adapted to examine other immune cell subsets such as B lymphocytes and innate immune cells and can be modified to include other tissue types. The digestion step is critical and has to be modified and optimized for each tissue9. A prolonged digestion step or the use of an inappropriate enzyme can affect the stability of antigen expression. Similar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 FL에 미국 심장 협회 (American Heart Association) 원정대 상 (16POST29950007), 건강 (NIH T32 HL069765) BLD, MA 살레에 미국 심장 협회 (American Heart Association) 원정대 상 (14POST20420025) 중 국립 연구소에서 훈련 보조금 및 NIH에 의해 지원되었다 K08 상 MSM에 (HL121671). MSM은 길르앗 과학, Inc.의 연구 보조금에 의해 지원됩니다
Materials
| Collagenase D | ROCHE | 11088882001 | |
| Collagenase A | ROCHE | 10103586001 | |
| Collagenase B | ROCHE | 11088815001 | |
| Dnase | ROCHE | 10104159001 | |
| 1X Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RPMI Medium 1614 1X | Gibco | 11835-030 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-144 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | For density gradient centrifugation |
| GentleMACS ™ C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use the program SPLEEN_04 |
| Cell activation cocktail (with Brefeldin A) | Biolegend | 423303 | |
| anti-CD16/32 | eBioscience | 14-0161-81 | dilute 1:100 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Life Technologies | L34955 | |
| Transcription factor buffer set | BD Pharmingen | 562725 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| 123 count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CD45 AmCyan (clone 30-F11) | BioLegend | 103138 | |
| CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) | BioLegend | 100218 | |
| IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) | BioLegend | 506910 | |
| IL-17F APC (clone 9D3.1C8) | BioLegend | 517004 | |
| CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) | BD Biosciences | 560181 | |
| CD8 APC (clone 53-67) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) | BioLegend | 644823 | |
| IFNγ FITC (clone XMG1.2) | BD Biosciences | 557724 |
References
- Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation. J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).
- Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55 (2), 500-507 (2010).
- Laroumanie, F., Douin-Echinard, V., Pozzo, J., et al. CD4+ T Cells Promote the Transition From Hypertrophy to Heart Failure During Chronic Pressure Overload. Circulation. 129 (21), 2111-2124 (2014).
- Guzik, T. J., Hoch, N. E., Brown, K. A., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).
- Ketelhuth, D. F. J., Hansson, G. K. Adaptive Response of T and B Cells in Atherosclerosis. Circ Res. 118 (4), 668-678 (2016).
- McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, Immunity, and Hypertensive End-Organ Damage. Circ Res. (6), 1022-1033 (2015).
- Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., et al. CD4+T Cells: Differentiation and Functions. Clin Dev Immunol. 2012, 1-12 (2012).
- Mittrücker, H. -. W., Visekruna, A., Huber, M. Heterogeneity in the differentiation and function of CD8+ T cells. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 62 (6), 449-458 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
- Finak, G., Langweiler, M., Jaimes, M., et al. Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium. Sci Rep. 6, 20686 (2016).
- Herzenberg, L. A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M., Herzenberg, L. A. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Hrvatin, S., Deng, F., O’Donnell, C. W., Gifford, D. K., Melton, D. A. MARIS: method for analyzing RNA following intracellular sorting. PLoS One. 9 (3), 89459 (2014).
- Kalisky, T., Quake, S. R. Single-cell genomics. Nat Methods. 8 (4), 311-314 (2011).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: Today’s technology and tomorrow’s horizons. Methods. 57 (3), 251-258 (2012).
- Jiang, L., Tixeira, R., Caruso, S., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nat Protoc. 11 (4), 655-663 (2016).
- Lemoine, S., Jaron, B., Tabka, S., et al. Dectin-1 activation unlocks IL12A expression and reveals the TH1 potency of neonatal dendritic cells. J Allergy Clin Immunol. 136 (5), 1355-1368 (2015).
- Gaublomme, J. T., Yosef, N., Lee, Y., et al. Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity. Cell. 163 (6), 1400-1412 (2015).
