La tinción intracelular y citometría de flujo para identificar subconjuntos de linfocitos dentro de murino aorta, riñón y los ganglios linfáticos en un modelo de hipertensión
Summary
Este artículo proporciona una metodología detallada para identificar y cuantificar los subconjuntos de linfocitos T funcionales presentes dentro de riñón murino, la aorta y los ganglios linfáticos mediante tinción intracelular y citometría de flujo. El modelo de hipertensión inducida por angiotensina II fue elegido para explicar, paso a paso, los procedimientos y los principios fundamentales de la citometría de flujo y tinción intracelular.
Abstract
It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.
Introduction
La evidencia reciente demuestra que el sistema inmune adaptativo, en particular los linfocitos T, juegan un papel crítico en el desarrollo de varias enfermedades cardiovasculares 1,2,3,4,5. Por ejemplo, en el modelo de la hipertensión inducida por la angiotensina II, una acumulación de células T en los vasos y los riñones de ratones se ha descrito 6. La acumulación vascular es predominantemente en la adventicia y la grasa perivascular. En el riñón, las células T se acumulan tanto en la médula y la corteza renal. Dependiendo de qué subconjunto está involucrado, estas células T dan lugar a diferentes citoquinas que pueden afectar la función vascular y renal y conducir al desarrollo de la patología (revisado por McMaster et al. 6).
Los linfocitos T auxiliares CD4 + se pueden dividir en varios subconjuntos: las células T helper 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, Th22, las células T reguladoras (Treg), y T helper folicular (TFH) en base a sus funciones y cito firmakines 7. Del mismo modo, las células CD8 + T citotóxicos se pueden clasificar como Tc1, Tc2, TC17 o TC9 8. También hay células T negativas dobles (es decir, células que no expresan el CD4 o CD8 marcadores de células T). Un subconjunto de estas células poseen una gamma delta del receptor de células T alternativa (en lugar de los receptores alfa y beta clásicas) y por lo tanto se conocen como células T gamma delta. El análisis de múltiples parámetros mediante citometría de flujo de marcador de superficie, citoquinas y factores de transcripción constituye el mejor enfoque para identificar estas células. Aunque este método se usa ampliamente en el campo de la inmunología, es menos bien descrito en órganos sólidos y en el contexto de las enfermedades cardiovasculares.
Históricamente, la identificación de los linfocitos en los tejidos se limitó a inmunohistoquímica o enfoques de RT-PCR. Aunque inmunohistoquímica e inmunofluorescencia son poderosos métodos para determinar la distribución tisular de un antígeno de interest, son inadecuados para identificar fenotípicamente los subconjuntos implicados. Además, mientras que el análisis RT-PCR es útil para detectar la expresión de ARNm de antígenos, citoquinas o factores de transcripción, que no permite la detección de múltiples proteínas simultáneamente a nivel de células individuales.
El advenimiento de la citometría de flujo, especialmente cuando se combina con la tinción intracelular para detectar citoquinas y factores de transcripción, proporciona a los investigadores con una técnica poderosa que permite la identificación y cuantificación en el nivel de células individuales de subconjuntos de células inmunes en órganos sólidos. Hemos optimizado un ensayo de tinción intracelular para identificar mediante citometría de flujo las principales subconjuntos de células T presentes dentro de riñón murino, aorta y aorta ganglios linfáticos de drenaje en un modelo de hipertensión inducida por la angiotensina II. La optimización de cada etapa: la digestión de tejidos, la activación ex vivo, la permeabilización, y la superficie y resultados de la tinción intracelular en una altamente reensayo producible que se puede aplicar a otros modelos de enfermedades cardiovasculares y renales.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described herein has been optimized to properly identify T cell subsets present within murine kidneys, aorta and lymph nodes. This protocol can be easily adapted to examine other immune cell subsets such as B lymphocytes and innate immune cells and can be modified to include other tissue types. The digestion step is critical and has to be modified and optimized for each tissue9. A prolonged digestion step or the use of an inappropriate enzyme can affect the stability of antigen expression. Similar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por un premio de la Asociación Americana del Corazón Fellowship (16POST29950007) a FL, una beca de formación de los Institutos Nacionales de Salud (NIH T32 HL069765) de DAC, un premio de la Asociación de Becarios Americana del Corazón (14POST20420025) para MA Saleh, y un NIH premio K08 (HL121671) a los HSH. El MSM también es apoyado por una beca de investigación de Gilead Sciences, Inc.
Materials
| Collagenase D | ROCHE | 11088882001 | |
| Collagenase A | ROCHE | 10103586001 | |
| Collagenase B | ROCHE | 11088815001 | |
| Dnase | ROCHE | 10104159001 | |
| 1X Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RPMI Medium 1614 1X | Gibco | 11835-030 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-144 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | For density gradient centrifugation |
| GentleMACS ™ C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use the program SPLEEN_04 |
| Cell activation cocktail (with Brefeldin A) | Biolegend | 423303 | |
| anti-CD16/32 | eBioscience | 14-0161-81 | dilute 1:100 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Life Technologies | L34955 | |
| Transcription factor buffer set | BD Pharmingen | 562725 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| 123 count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CD45 AmCyan (clone 30-F11) | BioLegend | 103138 | |
| CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) | BioLegend | 100218 | |
| IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) | BioLegend | 506910 | |
| IL-17F APC (clone 9D3.1C8) | BioLegend | 517004 | |
| CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) | BD Biosciences | 560181 | |
| CD8 APC (clone 53-67) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) | BioLegend | 644823 | |
| IFNγ FITC (clone XMG1.2) | BD Biosciences | 557724 |
References
- Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation. J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).
- Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55 (2), 500-507 (2010).
- Laroumanie, F., Douin-Echinard, V., Pozzo, J., et al. CD4+ T Cells Promote the Transition From Hypertrophy to Heart Failure During Chronic Pressure Overload. Circulation. 129 (21), 2111-2124 (2014).
- Guzik, T. J., Hoch, N. E., Brown, K. A., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).
- Ketelhuth, D. F. J., Hansson, G. K. Adaptive Response of T and B Cells in Atherosclerosis. Circ Res. 118 (4), 668-678 (2016).
- McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, Immunity, and Hypertensive End-Organ Damage. Circ Res. (6), 1022-1033 (2015).
- Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., et al. CD4+T Cells: Differentiation and Functions. Clin Dev Immunol. 2012, 1-12 (2012).
- Mittrücker, H. -. W., Visekruna, A., Huber, M. Heterogeneity in the differentiation and function of CD8+ T cells. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 62 (6), 449-458 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
- Finak, G., Langweiler, M., Jaimes, M., et al. Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium. Sci Rep. 6, 20686 (2016).
- Herzenberg, L. A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M., Herzenberg, L. A. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Hrvatin, S., Deng, F., O’Donnell, C. W., Gifford, D. K., Melton, D. A. MARIS: method for analyzing RNA following intracellular sorting. PLoS One. 9 (3), 89459 (2014).
- Kalisky, T., Quake, S. R. Single-cell genomics. Nat Methods. 8 (4), 311-314 (2011).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: Today’s technology and tomorrow’s horizons. Methods. 57 (3), 251-258 (2012).
- Jiang, L., Tixeira, R., Caruso, S., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nat Protoc. 11 (4), 655-663 (2016).
- Lemoine, S., Jaron, B., Tabka, S., et al. Dectin-1 activation unlocks IL12A expression and reveals the TH1 potency of neonatal dendritic cells. J Allergy Clin Immunol. 136 (5), 1355-1368 (2015).
- Gaublomme, J. T., Yosef, N., Lee, Y., et al. Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity. Cell. 163 (6), 1400-1412 (2015).
