Внутриклеточные Окрашивание и проточной цитометрии для идентификации субпопуляций лимфоцитов в пределах мышиной аорте, почек и лимфатических узлов в модели артериальной гипертензии
Summary
В данной статье приводится подробная методика для идентификации и количественного определения функциональных подмножеств Т-лимфоцитов, присутствующих в мышиной почек, аорты и лимфатических узлов с помощью внутриклеточного окрашивания и проточной цитометрии. была выбрана модель ангиотензина II, индуцированной гипертонии объяснить, шаг за шагом, процедуры и основополагающие принципы проточной цитометрии и внутриклеточного окрашивания.
Abstract
It is now well known that T lymphocytes play a critical role in the development of several cardiovascular diseases1,2,3,4,5. For example, studies from our group have shown that hypertension is associated with an excessive accumulation of T cells in the vessels and kidney during the development of experimental hypertension6. Once in these tissues, T cells produce several cytokines that affect both vascular and renal function leading to vasoconstriction and sodium and water retention1,2. To fully understand how T cells cause cardiovascular and renal diseases, it is important to be able to identify and quantify the specific T cell subsets present in these tissues. T cell subsets are defined by a combination of surface markers, the cytokines they secrete, and the transcription factors they express. The complexity of the T cell population makes flow cytometry and intracellular staining an invaluable technique to dissect the phenotypes of the lymphocytes present in tissues. Here, we provide a detailed protocol to identify the surface and intracellular markers (cytokines and transcription factors) in T cells isolated from murine kidney, aorta and aortic draining lymph nodes in a model of angiotensin II induced hypertension. The following steps are described in detail: isolation of the tissues, generation of the single cell suspensions, ex vivo stimulation, fixation, permeabilization and staining. In addition, several fundamental principles of flow cytometric analyses including choosing the proper controls and appropriate gating strategies are discussed.
Introduction
Последние данные свидетельствуют о том, что адаптивная иммунная система, в частности , Т – лимфоциты, играют решающую роль в развитии ряда сердечно – сосудистых заболеваний 1,2,3,4,5. Например, в модели ангиотензина II , индуцированной гипертонии, накопление Т – клеток в сосудах и почках мышей было описано 6. Накопление сосудистой преимущественно в адвентиции и периваскулярные жира. В почках, Т-клетки накапливаются в обоих мозговом веществе и корковом веществе почек. В зависимости от того, какое подмножество участвует, эти Т – клетки вызывают различные цитокины , которые могут влиять на сосудистую и функцию почек и приводят к развитию патологии (обзор McMaster и др. 6).
CD4 + Т – хелперные лимфоциты могут быть разделены на несколько подмножеств: Т – хелперов 1 (Th1), Th2, Th9, Th17, Th22, Т – регуляторные (Treg клетки), и Т фолликулярная хелперные (TFH) клеток на основе их функций и подписи цитоkines 7. Точно так же, CD8 + , цитотоксические Т – клетки могут быть классифицированы как ТС1 Tc2, Tc17 или Tc9 8. Существуют также двойные негативные Т – клетки (например , клетки , которые не экспрессируют CD4 или CD8 Т – маркеров клетки). Часть этих клеток обладают альтернативный гамма-дельта-Т-клеточный рецептор (вместо классического альфа- и бета-рецепторы), и поэтому они упоминаются как гамма-дельта Т-клеток. Анализ многопараметрической проточной цитометрии поверхностным маркером, цитокина и фактора транскрипции представляет собой наилучший подход для идентификации этих клеток. Хотя этот метод широко используется в области иммунологии, он менее хорошо описаны в солидных органов и в условиях сердечно-сосудистых заболеваний.
Исторически сложилось так, идентификация лимфоцитов в тканях было ограничено иммуногистохимии или ОТ-ПЦР подходов. Хотя иммуногистохимии и иммунофлуоресценции мощные методы для определения распределения ткани антигена Interest, они недостаточны для того чтобы определить фенотипически подмножества участвующих. Кроме того, в то время как анализ ОТ-ПЦР является полезным для выявления экспрессии мРНК антигенов, как цитокины или факторы транскрипции, он не позволяет обнаруживать нескольких белков одновременно на уровне отдельных клеток.
Появление проточной цитометрии, особенно в сочетании с внутриклеточным окрашиванием для выявления цитокинов и факторов транскрипции, обеспечивает исследователей с мощной техникой, что позволяет идентифицировать и количественно определять на уровне одной клетки подмножеств иммунных клеток в солидных органов. Мы оптимизировали внутриклеточный анализ окрашивания для идентификации с помощью проточной цитометрии основных Т-клеточных подмножеств, присутствующих в мышиной почке, аорты и аортального дренирующих лимфатических узлов в модели ангиотензина II, индуцированной гипертонии. Оптимизация каждого шага: ткани пищеварения, исключая виво активации, пермеабилизации, и поверхностные и внутриклеточные результаты окрашивания в высоко повторнопроизводимое анализа, которые могут быть применены к другим сердечно-сосудистых и почечных моделей заболеваний.
Protocol
Representative Results
Discussion
The protocol described herein has been optimized to properly identify T cell subsets present within murine kidneys, aorta and lymph nodes. This protocol can be easily adapted to examine other immune cell subsets such as B lymphocytes and innate immune cells and can be modified to include other tissue types. The digestion step is critical and has to be modified and optimized for each tissue9. A prolonged digestion step or the use of an inappropriate enzyme can affect the stability of antigen expression. Similar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана премии Американской кардиологической ассоциации стипендий (16POST29950007) в FL, учебный грант от Национального института здоровья (NIH T32 HL069765) к BLD, ассоциация стипендий премии American Heart (14POST20420025) М.А. Салеха и NIH K08 награду (HL121671) МСМ. МСМ также поддерживается исследовательский грант от Gilead Sciences, Inc.
Materials
| Collagenase D | ROCHE | 11088882001 | |
| Collagenase A | ROCHE | 10103586001 | |
| Collagenase B | ROCHE | 11088815001 | |
| Dnase | ROCHE | 10104159001 | |
| 1X Red blood cell lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RPMI Medium 1614 1X | Gibco | 11835-030 | |
| DPBS without calcium and magnesium | Gibco | 14190-144 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-5445-02 | For density gradient centrifugation |
| GentleMACS ™ C tube | Miltenyi Biotec | 130-096-334 | |
| GentleMACS dissociator device | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | Use the program SPLEEN_04 |
| Cell activation cocktail (with Brefeldin A) | Biolegend | 423303 | |
| anti-CD16/32 | eBioscience | 14-0161-81 | dilute 1:100 |
| LIVE/DEAD fixable violet dead cell stain kit | Life Technologies | L34955 | |
| Transcription factor buffer set | BD Pharmingen | 562725 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| 123 count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
| CD45 AmCyan (clone 30-F11) | BioLegend | 103138 | |
| CD3 PerCP-Cy5.5 (clone 17A2) | BioLegend | 100218 | |
| IL-17A FITC (clone TC11-18H10.1) | BioLegend | 506910 | |
| IL-17F APC (clone 9D3.1C8) | BioLegend | 517004 | |
| CD4 APC-Cy7 (clone GK1.5) | BD Biosciences | 560181 | |
| CD8 APC (clone 53-67) | eBioscience | 17-0081-82 | |
| T-bet PE-Cy7 (clone 4B10) | BioLegend | 644823 | |
| IFNγ FITC (clone XMG1.2) | BD Biosciences | 557724 |
References
- Saleh, M. A., McMaster, W. G., Wu, J., et al. Lymphocyte adaptor protein LNK deficiency exacerbates hypertension and end-organ inflammation. J Clin Invest. 125 (3), 1189-1202 (2015).
- Madhur, M. S., Lob, H. E., McCann, L. A., et al. Interleukin 17 promotes angiotensin II-induced hypertension and vascular dysfunction. Hypertension. 55 (2), 500-507 (2010).
- Laroumanie, F., Douin-Echinard, V., Pozzo, J., et al. CD4+ T Cells Promote the Transition From Hypertrophy to Heart Failure During Chronic Pressure Overload. Circulation. 129 (21), 2111-2124 (2014).
- Guzik, T. J., Hoch, N. E., Brown, K. A., et al. Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction. J Exp Med. 204 (10), 2449-2460 (2007).
- Ketelhuth, D. F. J., Hansson, G. K. Adaptive Response of T and B Cells in Atherosclerosis. Circ Res. 118 (4), 668-678 (2016).
- McMaster, W. G., Kirabo, A., Madhur, M. S., Harrison, D. G. Inflammation, Immunity, and Hypertensive End-Organ Damage. Circ Res. (6), 1022-1033 (2015).
- Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., et al. CD4+T Cells: Differentiation and Functions. Clin Dev Immunol. 2012, 1-12 (2012).
- Mittrücker, H. -. W., Visekruna, A., Huber, M. Heterogeneity in the differentiation and function of CD8+ T cells. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 62 (6), 449-458 (2014).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur J Microbiol Immunol (Bp). 2 (2), 112-120 (2012).
- Finak, G., Langweiler, M., Jaimes, M., et al. Standardizing Flow Cytometry Immunophenotyping Analysis from the Human ImmunoPhenotyping Consortium. Sci Rep. 6, 20686 (2016).
- Herzenberg, L. A., Parks, D., Sahaf, B., Perez, O., Roederer, M., Herzenberg, L. A. The history and future of the fluorescence activated cell sorter and flow cytometry: a view from Stanford. Clin Chem. 48 (10), 1819-1827 (2002).
- Hrvatin, S., Deng, F., O’Donnell, C. W., Gifford, D. K., Melton, D. A. MARIS: method for analyzing RNA following intracellular sorting. PLoS One. 9 (3), 89459 (2014).
- Kalisky, T., Quake, S. R. Single-cell genomics. Nat Methods. 8 (4), 311-314 (2011).
- Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: Today’s technology and tomorrow’s horizons. Methods. 57 (3), 251-258 (2012).
- Jiang, L., Tixeira, R., Caruso, S., et al. Monitoring the progression of cell death and the disassembly of dying cells by flow cytometry. Nat Protoc. 11 (4), 655-663 (2016).
- Lemoine, S., Jaron, B., Tabka, S., et al. Dectin-1 activation unlocks IL12A expression and reveals the TH1 potency of neonatal dendritic cells. J Allergy Clin Immunol. 136 (5), 1355-1368 (2015).
- Gaublomme, J. T., Yosef, N., Lee, Y., et al. Single-Cell Genomics Unveils Critical Regulators of Th17 Cell Pathogenicity. Cell. 163 (6), 1400-1412 (2015).
