Sublimation de DAN Matrice pour la détection et la visualisation des gangliosides dans Rat Tissue Brain MALDI Imaging Mass Spectrometry

Laser Désorption assistée Matrice / ionisation (MALDI) d'imagerie Spectrométrie de masse (IMS) est devenue une technique très recherchée pour la visualisation de la distribution spatiale des lipides, des peptides et des protéines à travers les surfaces des échantillons intacts. MALDI IMS a été précédemment connu comme une technique d'analyse pour les analytes pré-purifiée, mais ces dernières années, il a attiré l'attention dans beaucoup d'autres disciplines en raison de la possibilité de combiner la précision de la spectrométrie de masse avec des points à haute résolution visuelle / de référence anatomiques sans besoin de tout étiquetage externe. Comme la piscine scientifique des chercheurs utilisant cette technique ne cesse de croître, il est un besoin accru pour des protocoles normalisés faciles à suivre pour aider dans le développement et l'optimisation des expériences IMS. Gangliosides, un groupe de lipides membranaires très abondantes dans le système nerveux central, sont idéales pour des expériences MALDI IMS comme leur emplacement, noyé dans la membrane, rend certaines spécies impossible à détecter en utilisant Immuno-marquage conventionnel. En outre, nous avons montré, en utilisant MALDI IMS, que ces lipides, qui fonctionnent comme des modulateurs de la signalisation cellulaire, entre autres, ont des modèles uniques de distribution anatomique dans le cerveau des rongeurs en bonne santé qui sont modifiés après une lésion cérébrale ^{3, 4, 5.} Les gangliosides sont situés à une plage de masse plus élevée par rapport à la plupart des espèces de lipides, et sont donc plus adapté à la plate-forme d'imagerie MALDI.

Figure 1: Flux de MALDI IMS Experiment. Schéma du processus général d'une expérience MALDI IMS en utilisant la sublimation. Tissu congelé à -80 ° C est sectionnée dans un cryostat et 10 um sections sont montées sur des lames dégel ITO conductrices. La lame est ensuite placé dans un dessicateur jusqu'à ce que la sublimation. Slides sont insérés dans l'appareil de sublimation et une couche uniforme de matrice est appliquée sur la surface de l'échantillon de tissu. Les échantillons sont congelés pendant une nuit dans un congélateur C -20 ° C, puis placé dans un dessicateur pendant 10 minutes. Une fois que des normes ont été appliquées, les échantillons sont insérés dans l'instrument MALDI lorsqu'un laser est dirigé à travers le tissu provoquant des molécules désorbées dans la matrice pour ioniser. Les ions se déplacent dans un tube de vol et séparés en fonction de leur masse (/ TOF temps de vol) jusqu'à ce qu'ils atteignent le détecteur. Les informations sur l'abondance ionique d'analytes dans une masse à charge (m / z) plage prédéterminée apparaît à la fois comme une image moléculaire et le spectre de masse. Ces données peuvent être utilisées à la fois visualiser et de quantifier l'abondance ionique de l'analyte d'intérêt dans le tissu imagé. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

La préparation des échantillonspour MALDI IMS est très variable que chaque étape du processus doit être adapté aux analytes d'intérêt. La principale caractéristique des expériences basées MALDI est l'utilisation d'un revêtement de matrice déposée sur la surface de l'échantillon avant l'analyse. En plus du rôle d'absorber et de transférer de l' énergie de rayonnement provenant du laser pendant le processus d'ablation, la matrice sert également à isoler les divers analytes de l'échantillon, ce qui facilite l'analyse des composés d'intérêt ^{6, 7.} une application homogène de la matrice à la surface de l'échantillon est l'étape la plus cruciale dans le processus de préparation des échantillons. Dépôt de matrice incorrecte peut conduire à de grandes formations hétérogènes matrice de cristal et le développement d'artefacts, de faible ion signal, et une faible reproductibilité ^7.

En raison de l'affinité de certaines matrices pour isoler des analytes spécifiques, le type de matrice choisi pour une expérience peutmodifier considérablement le résultat. Les matrices utilisées pour l'imagerie des protéines et des peptides diffèrent souvent de ceux utilisés pour les lipides de l'imagerie et le processus est encore compliqué par la nécessité de procédures supplémentaires telles que lavage et réhydratation étapes afin de détecter avec succès les signaux à partir du tissu. Bien que des étapes de lavage existent pour l'amélioration des signaux lipidiques ^8, ils ne sont pas une condition préalable pour la détection de la plupart des espèces lipidiques. Lors de la sélection d'une matrice pour une expérience d'imagerie de lipides, il est important de tenir compte de la polarité du lipide intéressant car cela restreindre la gamme de matrices appropriées. Par exemple, les gangliosides contiennent des résidus d'acide sialique qui leur confèrent une polarité négative globale. Il existe un certain nombre de matrices qui peuvent efficacement désorber et ioniser les gangliosides du tissu; Cependant, des facteurs tels que les pics de la matrice dérivée du spectre et de la stabilité de la matrice sous vide doivent être prises en considération. 1,5-diaminonapthalene (DUne matrice) est suffisamment stable dans des conditions de vide de l' instrument pour la majorité des applications d'imagerie et a démontré un haut degré de sensibilité pour les lipides désorption et peut être utilisé pour l'analyse des lipides dans les deux modes positifs et négatifs ions ^2. Matrice DAN, par rapport à d'autres matrices lipidiques par affinité négative tels que l'acide dihydroxybenzoïque (DHB), 9-aminoacridine (9-AA) et 5-chloro-2-mercaptobenzothiazole (CMBT), a été capable de désorber le plus efficacement possible les gangliosides de cerveau de rat un tissu en mode ion négatif (manuscrit en préparation).

Sélection de la méthode appropriée de dépôt de la matrice est d'une importance égale à la sélection de la matrice elle-même. des procédés de dépôt par voie humide de matrice dans lequel la matrice solide est dissous dans un solvant organique et déposé par pneumatique ou pulvérisateurs ou les observateurs Automatisé, sont particulièrement efficaces pour la désorption des protéines et des peptides tels que le liquide imprègne l'échantillon pour permettre supplémentairection de composés et de co-cristallisation avec la matrice. Bien que ces techniques peuvent également être utilisées pour des applications lipidiques, l' analyte et la délocalisation des formations de cristaux de matrice inégale sont fréquentes en raison de la forte abondance et la solubilité dans les solvants des lipides, en particulier dans le tissu ^{2, 9.} Parce que les lipides sont facilement ionisées à partir de tissus, les techniques sèches de dépôt de matrice, tels que la sublimation, offrent une solution de rechange simple et efficace pour les pulvérisateurs tout en évitant beaucoup de l'inconvénient de ces techniques. Le succès de la sublimation dans des expériences MALDI IMS est attribué à des fonctions telles que la matrice microcristalline morphologie qui augmente l'aire de surface pour la matrice de l' analyte de liaison, une pureté accrue de la matrice, et le dépôt de matrice homogène conduisant à une augmentation de la reproductibilité par rapport aux techniques de matrice humide ^{1, 10.}

sublimation involves le chauffage d'une poudre de matrice sous vide immédiatement en dessous d'une surface d'échantillon refroidi résultant à l'état solide à la transition en phase gazeuse de la matrice en poudre suivie par le dépôt sur la surface de l'échantillon de tissu. Pendant la sublimation, le dépôt de la matrice peut être contrôlée par divers facteurs tels que le temps, la température et la pression pour obtenir des résultats hautement reproductibles. Une expérience de sublimation unique peut durer entre 5 et 20 min en fonction du type de matrice choisie, qui peut être réutilisé plusieurs fois avant d'être éliminés. L'appareil peut être acheté dans le commerce, à une fraction du prix des pulvérisateurs automatisés et est facilement démontable pour le nettoyage et l'entretien. Le faible coût et la simplicité relative de cette technique de dépôt de la matrice, il est idéal pour les chercheurs débutants ou en expansion sur les applications d'imagerie de lipides dans MALDI IMS. Bien que des informations détaillant les protocoles pour la sublimation des tissus pour IMS ont été rapportés ^11, quelques protocoles normalisés existent wUEL se concentrer sur le flux de travail de base impliqués dans la réalisation d'une expérience de sublimation pour l'imagerie lipides élevés de masse en mode d'ions négatifs, ce qui rend difficile d'établir la technique sans vaste essai et erreur. Ce qui suit est un protocole expérimental visant à combler cette lacune pour la sublimation de la matrice DAN sur des coupes de cerveau de rat pour l'imagerie à haute résolution et la détection des gangliosides.

Figure 2: Sublimation Appareil. Photographie (A) et diagramme schématique (B) de l'appareil de sublimation. La pompe à vide est reliée par un tube en caoutchouc pour un piège à froid rempli avec 300 ml d'éthanol. Le piège froid est alors relié par un tube en caoutchouc à l'appareil de sublimation. L'appareil est composé de deux pièces séparées de verrerie qui sont scellés ensemble avec un joint en U métallique. La moitié supérieure de la sublimateurcontient le condenseur qui est rempli de glace pilée. La plaque d'échantillon est collé sur le fond du condenseur, à l'intérieur du récipient de verre scellé. La moitié inférieure de l'appareil de sublimation comprend la matrice DAN, répartis de façon uniforme en regard de la plaque d'échantillons. Pendant la sublimation, l'appareil de verre est placé dans un bain chauffé à 140 ° C, de sable par une plaque chauffante placée directement en dessous. La sonde de température permet de maintenir une température constante tout au long de l'expérience de sublimation par rétroaction de la température du bain de sable par rapport à la température de consigne pour l'expérience. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.