Sublimación de DAN Matriz para la detección y visualización de gangliósidos en el tejido cerebral de la rata por MALDI Imaging Espectrometría de Masas

Asistida por matriz de desorción láser / ionización (MALDI) Imaging Espectrometría de Masas (IMS) se está convirtiendo en un codiciado técnica para la visualización de la distribución espacial de los lípidos, péptidos y proteínas a través de superficies de muestras intactas. MALDI IMS era conocido previamente como una técnica analítica para analitos pre-purificado, pero en los últimos años, se ha llamado la atención en muchas otras disciplinas debido a la capacidad de combinar la exactitud de la espectrometría de masas con puntos de referencia de alta resolución visuales / anatómicas sin la necesitará para cualquier etiquetado externo. Como la piscina científica de los investigadores que utilizan esta técnica sigue creciendo, hay una mayor necesidad de protocolos estandarizados y fáciles de seguir para ayudar en el desarrollo y optimización de experimentos IMS. Los gangliósidos, un grupo de lípidos de membrana muy abundantes en el sistema nervioso central, son ideales para experimentos de MALDI IMS como su ubicación, incrustado dentro de la membrana, hace cierta especificidadit imposible detectar el uso de Inmuno-etiquetado convencional. Además, hemos demostrado, usando MALDI IMS, que estos lípidos, que funcionan como moduladores de la señalización celular, entre otras cosas, tienen patrones de distribución anatómica únicas en el cerebro de roedores sanos que son alterados después de la lesión cerebral ^{3, 4, 5.} Los gangliósidos se encuentran en un intervalo de masa superior en comparación con la mayoría de las especies de lípidos, y son por lo tanto más adaptado a la plataforma de imágenes MALDI.

Figura 1: Flujo de trabajo de MALDI IMS experimento. Diagrama del flujo de trabajo general de un experimento de MALDI IMS usando sublimación. El tejido congelado a -80 ° C se secciona en un criostato y 10 micras secciones son deshielo montado en portaobjetos de ITO conductores. El portaobjetos se coloca entonces en un desecador hasta la sublimación. SLIdes se inserta en el aparato de sublimación y se aplica una capa uniforme de la matriz a la superficie de la muestra de tejido. Las muestras se congelaron durante la noche en un congelador C -20 ° después se colocaron en un desecador durante 10 min. Una vez que se han aplicado las normas, las muestras se insertan en el instrumento MALDI donde un láser se dirige a través del tejido causando moléculas desorbidos en la matriz para ionizar. Los iones viajan por un tubo de vuelo y por separado en función de su masa (/ TOF tiempo-de-vuelo) hasta que alcanzan el detector. La información sobre la abundancia iónica de analitos dentro de un rango predeterminado de masa a carga (m / z) se muestra como tanto una imagen molecular y espectro de masas. Estos datos se pueden usar tanto para visualizar y cuantificar la abundancia iónica del analito de interés en el tejido de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

preparación de la muestrapor MALDI IMS es muy variable, ya que cada paso del proceso debe ser personalizado para los analitos de interés. La característica definitoria de experimentos basados ​​en MALDI es el uso de un revestimiento de matriz depositada sobre la superficie de la muestra antes del análisis. Además de la función de absorber y transferir energía de radiación del láser durante el proceso de ablación, la matriz también sirve para aislar diversos analitos de la muestra, lo que facilita el análisis de los compuestos de interés ^{6, 7.} una aplicación homogénea de la matriz a la superficie de la muestra es el paso más importante en el proceso de preparación de la muestra. La deposición de matriz incorrecta puede dar lugar a grandes formaciones heterogéneas cristal matriz y el desarrollo de artefactos, bajo la señal de iones, y la mala reproducibilidad ^7.

Debido a la afinidad de ciertas matrices para aislar analitos específicos, el tipo de matriz seleccionado para un experimento puedealterar de manera significativa el resultado. Las matrices utilizadas para la obtención de imágenes de proteínas y péptidos a menudo difieren de las utilizadas para los lípidos de formación de imágenes y el proceso se complica aún más por la necesidad de procedimientos adicionales, tales como lavado y rehidratación pasos con el fin de detectar con éxito las señales a partir de tejido. Aunque existen etapas de lavado para la mejora de las señales de lípidos ^8, no son un requisito previo para la detección de la mayoría de especies de lípidos. Al seleccionar una matriz para un experimento de formación de imágenes de lípidos, es importante tener en cuenta la polaridad de los lípidos de interés, ya que esto reducir la gama de matrices adecuadas. Por ejemplo, los gangliósidos contienen residuos de ácido siálico que les dan una polaridad negativa global. Hay una serie de matrices que pueden desorber e ionizar gangliósidos a partir de tejido de manera efectiva; Sin embargo, factores tales como picos derivadas de la matriz en el espectro y la estabilidad de la matriz al vacío deben ser tomados en consideración. 1,5-diaminonaftaleno (DAN) de la matriz es lo suficientemente estable en condiciones de vacío instrumento para la mayoría de aplicaciones de imágenes y ha demostrado un alto grado de sensibilidad para la desorción de los lípidos y se puede utilizar para el análisis de lípidos en ambos modos de iones positivos y negativos ^2. matriz DAN, en comparación con otras matrices de afinidad de lípidos negativos tales como el ácido dihidroxibenzoico (DHB), 9-aminoacridina (9-AA), y 5-cloro-2-mercaptobenzotiazol (CMBT), fue capaz de desorber más eficiente gangliósidos de cerebro de rata tejido en el modo de ion negativo (manuscrito en preparación).

Al seleccionar el método adecuado para la deposición de matriz es de igual importancia para la selección de la propia matriz. métodos de deposición de matriz húmeda en el que la matriz sólida se disuelve en un disolvente orgánico, y se depositan por neumático o pulverizadores o observadores automatizado, son particularmente eficaces para la desorción de proteínas y péptidos como el líquido impregna la muestra para permitir adicionalcción de compuestos y co-cristalización con la matriz. Aunque estas técnicas también se pueden utilizar para aplicaciones de lípidos, la deslocalización analito y formaciones de cristal de matriz desigual son sucesos comunes, debido a la gran abundancia y la solubilidad de los lípidos en disolventes, en particular en el tejido ^{2, 9.} Debido a que los lípidos se ionizan fácilmente a partir de tejidos, técnicas de deposición de matriz secos, como sublimación, ofrecen una alternativa sencilla y rentable para pulverizadores eludiendo las disposiciones que muchos de los inconvenientes de estas técnicas. El éxito de la sublimación en experimentos MALDI IMS se atribuye a características tales como la morfología de la matriz microcristalina lo que aumenta el área superficial para la matriz de unión a analito, el aumento de la pureza de la matriz, y la deposición de matriz homogénea que conducen a una mayor reproducibilidad en comparación con las técnicas de matriz húmeda ^{1, 10.}

invo sublimaciónLves calentamiento de una matriz de polvo bajo vacío inmediatamente por debajo de una superficie de la muestra enfriada resultante en forma sólida a la transición de fase gaseosa de la matriz en polvo seguido de la deposición sobre la superficie de la muestra de tejido. Durante la sublimación, deposición de la matriz puede ser controlado por factores variables tales como el tiempo, la temperatura y la presión para proporcionar resultados altamente reproducibles. Un experimento de la sublimación solo puede tomar de 5 a 20 minutos, dependiendo del tipo de matriz seleccionada, que puede ser reutilizado varias veces antes de su eliminación. El aparato puede ser comprado comercialmente a una fracción del precio de los pulverizadores automáticos y es fácilmente desmontado para su limpieza y mantenimiento. El bajo costo y la simplicidad relativa de esta técnica de deposición de la matriz, lo hacen ideal para los investigadores que comienzan o en expansión en aplicaciones de imágenes de lípidos en MALDI IMS. Aunque la información que detalla los protocolos para la sublimación de los tejidos para IMS se han reportado ^11, unos protocolos estandarizados existen which centrarse en el flujo de trabajo básico involucrado en la realización de un experimento de la sublimación para obtener imágenes de los lípidos de alto peso en el modo de iones negativos, por lo que es difícil establecer la técnica sin un amplio ensayo y error. El siguiente es un protocolo experimental con el objetivo de llenar ese hueco para la sublimación de la matriz de DAN en secciones de cerebro de rata para la formación de imágenes de alta resolución y detección de los gangliósidos.

Figura 2: Aparato de sublimación. La fotografía (A) y el diagrama esquemático (B) del aparato de sublimación. La bomba de vacío está conectada por un tubo de goma a una trampa fría llena con 300 ml de etanol. La trampa está entonces conectada por un tubo de goma al aparato de sublimación. El aparato se compone de dos piezas separadas de material de vidrio que están sellados juntos con un metal U-articulación. La mitad superior de la sublimadorcontiene el condensador que está lleno de aguanieve hielo. La placa de muestra se pega sobre la parte inferior del condensador, en el interior del aparato de vidrio sellado. La mitad inferior del aparato de sublimación contiene la matriz DAN, que se extiende de manera uniforme hacia la placa de muestra. Durante la sublimación, el aparato de vidrio se coloca en un baño de arena se calienta a 140 ° C por una placa caliente directamente debajo de ella. La sonda de temperatura ayuda a mantener una temperatura estable durante todo el experimento sublimación través de la retroalimentación de la temperatura del baño de arena en comparación con la temperatura predeterminada para el experimento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.