MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometre Rat Beyin Dokusu içinde gangliositler Saptanmasında ve Görselleştirme DAN Matrix Sublime
Summary
A protocol for the sublimation of DAN matrix onto rat brain tissue for the detection of gangliosides using MALDI Imaging Mass Spectrometry is presented.
Abstract
Örnek hazırlama uygun algılama ve matris destekli lazer çıkarma / iyonlaşma (MALDI) Görüntüleme Kütle Spektrometresi (IMS) deneylerde analitlerin görüntülenmesi için bir anahtardır. Her adım, ilgi analitlerin kendine özgü özellikleri olan uygun optimize edilmelidir olarak örnek hazırlama süreci boyunca takip uygun protokolü belirlemek zordur. Bu işlem sadece desorbe ve verimli bir şekilde ilgi konusu moleküllere iyonize bir uyumlu matris bulmak değil, aynı zamanda, uygun hücreler arasında madde birikmesi tekniği seçerek değil içermektedir. Kuru hücreler arasında madde birikmesi teknikleri lipidlerin iyonlaşma için özellikle etkili olan, oysa Örneğin, bir çözücü içinde bir matris eritme gerektirir ıslak matris birikim tekniği, en protein ve peptid desorpsiyonu için üstündür. Süblimasyon bağlı homogenei MALDI IMS ile doku lipidlerin saptanması için, kuru madde birikmesi son derece etkili bir yöntem olarak bildirilmiştirmatris kristal birikimi ve minimal analit yerel olmaktan ty birçok yaş çökelme yöntemleri 1, 2 ile karşılaştırıldığında. Genel olarak, bu soğuk bir yüzey bastırılır örnekleri ile bir vakum sızdırmaz bölme bir örnek ve toz haline getirilmiş bir matris yerleştirilmesini sağlar. Cihaz daha sonra soğutuldu doku örneği yüzeyi üzerine toz halinde matrisin süblimasyon ile sonuçlanan, bir ısıtılmış banyo (kum ya da yağ) içerisine indirilir. Burada MALDI IMS kullanarak sıçan beyninde gangliosidler tespiti ve görselleştirme için 1,5-diaminonaphthalene (DAN) matris kullanarak bir yüceltme protokol açıklar.
Introduction
Matriks destekli lazer desorpsiyon / İyonizasyon (MALDI) Görüntüleme Kütle Spektrometresi (IMS) giderek çok aranan bozulmamış numune yüzeyleri boyunca lipidler, peptidler ve proteinlerin mekansal dağılımı görüntülenmesi için tekniği sonra. MALDI IMS önceden önceden saflaştırılmış analitler için analitik tekniği olarak bilinen, ancak son yıllarda, bunun nedeni olmadan yüksek çözünürlüklü görsel / anatomik referans noktaları ile kütle spektrometresi doğruluğunu birleştirmek için yeteneği birçok diğer disiplinlerde dikkat çekmeye başlamıştır herhangi bir harici etiketlenmesi için gereklidir. Bu tekniği kullanan araştırmacıların bilimsel havuz büyümeye devam ettikçe, IMS deneyleri geliştirilmesi ve optimizasyonu yardımcı olmak için standartlaştırılmış, kolay takip protokolleri için ihtiyaç vardır artar. Gangliosidler, merkezi sinir sistemi içinde yüksek miktardaki membran lipidlerinin bir grup, membran içinde gömülü bulundukları yere gibi MALDI IMS deneyleri için idealdir, belirli bir speci yapargeleneksel immüno-etiketlemesi kullanılarak tespit etmek mümkün es. Buna ek olarak, hücre sinyalinin modülatörleri olarak işlev, bu yağlar, başka şeylerin yanı sıra, beyin hasarı 3, 4, 5, değişmiş sağlıklı kemirgen beyin benzersiz bir anatomik dağılımla desenlere sahip olduğunu, MALDI IMS kullanan göstermiştir. Gangliositler en lipit türlere kıyasla daha yüksek bir kütle aralığında bulunan ve böylece MALDI görüntüleme platformu en uygun çözümdür.
Şekil 1: MALDI IMS Deney iş akışı. süblimasyon kullanarak MALDI IMS deney genel iş akışı diyagramı. -80 ° C'de dondurulmuş doku, bir kriyostat bölümlere ve 10 um bölümler çözülme iletken İTO slaytlar üzerine monte edilir. Lam daha sonra süblimasyon kadar desikatör içine yerleştirilir. slides süblimasyon aparatına yerleştirilir ve matris düz bir katman doku örneği yüzeyine uygulanır. Numuneler daha sonra 10 dakika boyunca bir kurutucu içine yerleştirilmiş bir -20 ° C dondurucu içinde bir gece boyunca dondurulmuştur. standartlar uygulandıktan sonra, numuneler bir lazer iyonize matris içinde desorbe moleküllerin neden doku boyunca yönlendirilir MALDI cihazına yerleştirilir. iyonları onlar dedektöre ulaşana kadar kendi kütlesi (time-of-flight / TOF) dayalı bir uçuş tüp ve ayrı aşağı seyahat. önceden tespit edilmiş bir kütle-yük (m / z) aralığında analit iyonik miktarı hakkında bilgi molekül görüntü ve kütle spektrumu hem de gösterilir. Bu veriler, görselleştirmek ve görüntülü doku içinde ilgili analit iyonik bolluk ölçmek hem de kullanılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
örnek hazırlamasürecinin her adımı ilgi analitlerin özelleştirilebilir gerektiği gibi MALDI IMS çok değişkendir. MALDI-esaslı deneyler tanımlayıcı özelliği, analiz öncesi örnek yüzeyi üzerine biriktirilmiş bir matris kaplamanın kullanılmasıdır. Emici ve ablasyon esnasında lazer radyasyon enerji aktarmak rolüne ek olarak, bir matris ve böylece ilgi 6, 7 bileşiklerinin çözümlenmesini kolaylaştıran, örnek çeşitli analitlerin izole etmek için hizmet eder. Numune yüzeyine matris homojen bir uygulama örnek hazırlama sürecinde en önemli adımdır. Yanlış matris birikimi büyük heterojen matris kristal oluşumları ve eserler geliştirilmesi, düşük iyon sinyal ve kötü tekrarlanabilirlik 7 yol açabilir.
Belirli matrislerin afinite özel analitleri izole etmek için, matris tipi bir deney için seçilen nedeniyle canönemli ölçüde sonucu değiştirmez. protein ve peptid görüntüleme için kullanılan matris genellikle görüntüleme lipidler için kullanılanlardan farklı ve işlem bundan başka, başarılı bir dokudan sinyalleri tespit etmek için yıkama ve rehidrasyon adımları gibi ek işlemler için ihtiyaç tarafından karmaşıktır. Yıkama aşamaları lipit sinyalleri 8 arttırılması için mevcut olmasına rağmen, en çok lipit türlerinin tespiti için bir ön koşul değildir. bir lipid görüntüleme deney için bir matris seçerken, uygun matrislerin aralığını daraltmak bu kadar ilgi lipid kutuplarını dikkate almak önemlidir. Örneğin, gangliositler onlara genel bir olumsuz kutuplarını vermek sialik asit kalıntılarını içerir. etkin bir şekilde desorbe ve doku gangliosidler iyonize olabilir matrislerin vardır; Bununla birlikte, bu spektrum ve vakum altında matrisi matris türetilmiş tepe gibi faktörler dikkate alınarak alınmalıdır. 1,5-diaminonapthalene (DBİR) matris görüntüleme uygulamalarının çoğu için cihaz vakum koşulları altında yeterince sabit ve lipid desorpsiyonu için yüksek bir hassasiyet derecesi gösterdi ve pozitif ve negatif iyon modlarında 2 hem de lipid analizi için kullanılabilir. Bu dihidroksibenzoik asit (DHB), 9-aminoakridin'in (9-AA) ve 5-kloro-2-merkaptobenzotiazol (SPK) gibi diğer olumsuz lipit benzer matrislere karşılaştırıldığında DAN matrisi, en etkin bir şekilde fare beyninden gangliosidler desorbe mümkün negatif iyon modunda (hazırlama yazısı) doku.
matriks birikimi uygun yöntemi seçerek matrisi kendisi seçerek eşit öneme sahiptir. Sıvı ilave izin vermek için örnek nüfuz olarak katı matris bir organik çözücü içinde çözülmüş, ve pnömatik bertaraf veya püskürtme ya gözcü otomatik olup, burada ıslak hücreler arasında madde birikmesi yöntemleri, protein ve peptid desorpsiyonu için özellikle etkilidirmatrisle bileşikler ve ko-kristalizasyon ction. Bu teknikler ayrıca lipit uygulamaları, analit yerel olmaktan ve eşit olmayan bir matris kristal oluşumları için kullanılabilir, ancak özellikle ipek 2, 9 nedeniyle çözücü maddeler içinde yüksek lipid bolluk ve çözünürlüğüne ortak oluşumları vardır. lipidler kolayca dokudan iyonize olduğundan bu tekniklerin dezavantajı çok engellemeyi ederken, böyle yüceltme gibi kuru matriks birikimi teknikleri, püskürtme için basit, uygun maliyetli bir alternatif sunuyoruz. MALDI IMS deneylerde süblimasyon başarısı ıslak matris teknikleri 1, 10 ile karşılaştırıldığında artmış tekrar üretilebilirliğine yol açmaktadır, bağlayıcı matris analit için yüzey alanını arttırır mikrokristalin matrisi morfolojisi, artan matriks saflık ve homojen matris birikimi gibi özellikler ilişkilendirilir.
Sublime invoHemen doku numunesi yüzeyi üzerine biriktirme ardından toz haline getirilmiş matrisin gaz faz geçişi bir katı olarak elde soğutulmuş bir Örnek yüzeyinin altında, vakum altında, bir toz halinde matris ısıtma lves. süblimasyon sırasında hücreler arasında madde birikmesi, zaman, sıcaklık ve yüksek oranda çoğaltılabilir sonuçları sağlamak için basınç değişen faktörlere ile kontrol edilebilir. Tek bir yüceltme deney atmadan önce birkaç kez tekrar kullanılabilir, seçilen matris tipine bağlı 5 ila 20 dk sürebilir. Cihaz otomatik spreyler fiyatının bir kısmını piyasadan satın alınabilir ve kolayca temizlik ve bakım için ayrı alınır. düşük maliyetli ve bu matris birikim tekniği göreceli basitliği başlayan veya MALDI IMS lipid görüntüleme uygulamaları üzerine genişleyen araştırmacılar için ideal hale getirmektedir. IMS dokuların yüceltme için protokoller ayrıntılı bilgi 11 rapor edilmesine rağmen, birkaç standart protokoller w varhich zor geniş deneme ve yanılma olmadan tekniği kurmak için yapım, negatif iyon modunda yüksek kütle lipitleri görüntülenmesinde bir yüceltme deneyi yürüten ile ilgili temel iş akışı üzerinde durulacak. Aşağıdaki yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve gangliosidler tespiti için sıçan beyin kesitleri üzerine DAN matrisi yüceltme için bu boşluğu doldurmak amacıyla deneysel bir protokoldür.
Şekil 2: Süblimasyon cihaz. Fotoğraf (A) ve süblimasyon cihazının şematik bir diyagramı (B). Vakum pompası 300 ml etanol ile dolu bir soğuk kapan kauçuk boru ile bağlanır. Soğuk tuzak sonra yüceltme aparatına lastik boru ile bağlanır. Cihaz, bir metal U bağlantı ile birlikte kapatılır cam iki ayrı parçadan oluşmaktadır. inceltici üst yarısıbuz slush ile doldurulur kondenser içermektedir. Numune levhası, kapalı cam bir aparat içinde, bir kondansatör alt üzerine bantlanır. yüceltme aparatının alt yarısı eşit örnek plaka bakacak yaymak DAN matrisi içerir. süblimasyon sırasında cam Cihaz doğrudan altındaki sıcak levha ile 140 ° C'ye kadar ısıtıldı, bir kum banyosuna yerleştirilir. sıcaklık probu deney için önceden ayarlanmış sıcaklığa göre kum banyosu sıcaklığı geri bildirimler ile yüceltme deney boyunca istikrarlı bir sıcaklık korumaya yardımcı olur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, MALDI IMS deneylerde örneğin gangliosidler gibi negatif yüklü lipidler, tespiti için doku üzerinde matris süblimasyon standart bir protokolü göstermektedir. MALDI IMS numune hazırlama oldukça değişkendir ve ilgi analit eşsiz özelliklerini uyacak şekilde özelleştirilebilir olması gerekir. Doku örneği yüzeyi üzerine matrisin uygulanmasına IMS'de sonuçlar kalitesi açısından örnek hazırlama işleminin çok önemli bir yönüdür. Matris ilgi analit ile uyumludur ve spektrumun…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge the technical assistance of Kristina Jurcic in the University of Western Ontario MALDI MS facility, as well as the National Sciences and Engineering Council (NSERC) for funding this work. The authors would also like to acknowledge the Caprioli group (Vanderbilt University, TN) and Chaurand group (Université de Montreal, QC) for their advice in optimizing the sublimation technique presented in this manuscript.
Materials
| Sublimator | Chemglass Life Sciences | CG3038-01 | |
| 1,5- Diaminonapthalene (DAN) matrix | Sigma-Aldrich | D21200 | 100 G |
| Cryostat | Thermo-Fisher Scientific | CryoStar NX50 | |
| Hot plate with temperature feedback | Thermo-Fisher Scientific | HP88857290 | Isotemp ADVD 7×7 HP 100-120v |
| Stainless Steel Jack | Thermo-Fisher Scientific | 2216479 | 10×10 |
| Cold Trap | Custom built on site | ||
| Vacuum Pump | Franklin Electric | 1102180403 | Savant VP100 Two Stage |
| Indium-tin-oxide (ITO) Slides | Hudson Surface Technology | PSI 1111000 | type II, 1.1mm/25 each |
| MALDI TOF/TOF 5800 Instrument | AB Sciex | ||
| Desiccator | Sigma-Aldrich | D2797 | tabletop desiccator |
References
- Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 18, 1646-1652 (2007).
- Thomas, A., Charbonneau, J. L., Fournaise, E., Chaurand, P. Sublimation of new matrix candidates for high spatial resolution imaging mass spectrometry of lipids: enhanced information in both positive and negative polarities after 1,5-diaminonapthalene deposition. Anal. Chem. 84, 2048-2054 (2012).
- Caughlin, S., et al. Increased Expression of Simple Ganglioside Species GM2 and GM3 Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in a Combined Rat Model of Aβ Toxicity and Stroke. PLoS ONE. 10, 0130364 (2015).
- Weishaupt, N., Caughlin, S., Yeung, K., Whitehead, S. Differential Anatomical Expression of Ganglioside GM1 Species Containing d18:1 or d20:1 Sphingosine Detected by MALDI Imaging Mass Spectrometry in Mature Rat Brain. Front Neuroanatomy. 9 (155), (2015).
- Whitehead, S., et al. Imaging Mass Spectrometry Detection of Gangliosides Species in the Mouse Brain following Transient Focal Cerebral Ischemia and Long-Term Recovery. PLoS ONE. 6 (6), 20808 (2011).
- Fuchs, B., Süß, R., Schiller, J. An update of MALDI-TOF mass spectrometry in lipid research. Progress in Lipid Research. 49, 450-475 (2010).
- Barceló-Coblijn, G., Fernández, J. A. Mass spectrometry coupled to imaging techniques: the better the view the greater the challenge. Front Physiol. 6 (3), 1-5 (2015).
- Angel, P. M., Spraggins, J. M., Baldwin, H. S., Caprioli, R. Enhanced sensitivity for high spatial resolution lipid analysis by negative ion mode matrix assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry. Anal. Chem. 84, 1557-1564 (2012).
- Murphy, R. C., Hankin, J. A., Barkley, R. M., Zemski Berry, K. A. MALDI imaging of lipids after matrix sublimation/deposition. Biochim. Biophys. Acta. 1811, 970-975 (2011).
- Jaskolla, T. W., Karas, M., Roth, U., Steinert, K. Comparison between vacuum sublimed matrices and conventional dried droplet preparation in MALDI-TOF mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 1104-1115 (2009).
- O’Rourke, M. B., Raymond, B. B., Djordjevic, S. P., Padula, M. P. A versatile cost-effective method for the analysis of fresh frozen tissue sections via matrix-assisted laser desorption/ionisation imaging mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 29, 637-644 (2015).
- Patterson, N. H., Thomas, A., Chaurand, P. Monitoring time-dependent degradation of phospholipids in sectioned tissues by MALDI imaging mass spectrometry. J Mass Spectrom. 49, 622-627 (2014).
- Cheng, H., Sun, G., Yang, K., Gross, R. W., Han, X. Selective desorption/ionization of sulfatides by MALDI-MS facilitated using 9-aminoacridine as matrix. J. Lipid Res. 51, 1599-1609 (2010).
- Puolitaival, S. M., Burnum, K. E., Cornett, D. S., Caprioli, R. M. Solvent-free matrix dry-coating for MALDI imaging of phospholipids. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 19, 882-886 (2008).
- Chaurand, P., Cornett, D., Angel, P., Caprioli, R. From Whole-body Sections Down to Cellular Level, Multiscale Imaging of Phospholipids by MALDI Mass Spectrometry. Mol Cell Proteomics. 10, (2011).
- Grove, K. J., Frappier, S. L., Caprioli, R. M. Matrix pre-coated MALDI MS targets for small molecule imaging in tissues. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 22, 192-195 (2011).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix precoated targets for direct lipid analysis and imaging of tissue. Anal. Chem. 85, 2907-2912 (2013).
- Gemperline, E., Rawson, S., Li, L. Optimization and comparison of multiple MALDI matrix application methods for small molecule mass spectrometric imaging. Anal. Chem. 86, 10030-10035 (2014).
