Sıçan gözlerinin içine insan retina Pigment epitel hücrelerinin Trans-scleral Subretinal nakli için rafine bir protokol geliştirilmesi
Summary
Subretinal enjeksiyon kök hücre replasman tedavisi için yaşa bağlı makula dejenerasyonu preklinik çalışmalarda yaygın olarak uygulanmıştır. Görüntülenmeyecektir bu makalede, biz daha az riskli, tekrarlanabilir ve tam olarak değiştirilmiş subretinal enjeksiyon tekniğini hücrelerin sıçan gözlerinin içine sunmak için trans-scleral yaklaşım yoluyla tanımlamak.
Abstract
Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) gibi dejeneratif retinal hastalıkları geri döndürülemez görme kaybı dünya çapında önde gelen nedenidir. AMD bir monolayer işlevsel olarak destekleyen ve anatomik olarak sinirsel retina kaydırma hücre vardır retina pigment epitel (RPE) hücresi dejenerasyonu ile karakterizedir. Sigara neovasküler AMD (kuru AMD) için mevcut farmakolojik tedaviler yalnızca hastalık ilerleme yavaş ama vizyon, roman tedavi stratejileri belirleme amaçlı çalışmalar gerektiren geri yükleyemezsiniz. Dejeneratif RPE hücrelerinin sağlıklı hücreleri tutar söz ile kuru AMD gelecekte tedavi etmek için eski yerine koymak. Kök hücre kaynaklı RPE hücrelerinin nakli subretinal enjeksiyon tekniği uygulanacağı hayvan modellerin subretinal boşluğa dahil AMD için kök hücre yerine tedavilerin geniş preklinik çalışmaları. En sık preklinik bu hayvan çalışmalarda kullanılan iğne ucunun doğrudan görselleştirme eksikliği nedeniyle zor yapılan ve kez retina zarar görmesine neden trans-scleral rota üzerinden yaklaşımdır. Vitre alternatif bir yaklaşımla iğne Bitiş pozisyonu doğrudan gözlem için sağlar, ancak daha fazla göz doku rahatsız gibi cerrahi travma yüksek risk taşır. Biz başarıyla ve tutarlı bir şekilde RPE hücrelerinin sıçan subretinal boşluğa teslim ve aşırı retina zarar görmemesi için tanımlanmış iğne açılardan ve derinliklerden kullanan bir daha az riskli ve tekrarlanabilir değiştirilmiş trans-scleral enjeksiyon yöntemi geliştirdik. Bu şekilde teslim hücreleri daha önce en az 2 ay süreyle Cerrahlar Kraliyet Koleji (RCS) köstebeğiyle etkili olmak gösterilmiştir. Bu teknik sadece hücre transplantasyonu için aynı zamanda küçük moleküller veya gen tedavileri teslim etmek için kullanılabilir.
Introduction
İnsan retina göz fonksiyonları arka ışık duyusal mendil bulunan ve vizyon algı kritik bir rol oynamaktadır. Retina hücre fonksiyon bozukluğu veya hücre ölümü bu nedenle görme sorunları veya kalıcı körlüğe neden olur. Dejenerasyon veya disfonksiyon farklı katmanları retina hücreleri içeren bozukluklar arasında AMD en yaygın türü ve gelişmiş ülkelerde Yaşlılarda geri dönüşü olmayan körlük önde gelen nedenidir olan dejeneratif retina hastalıkları olarak bilinir 1,2. AMD patolojik süreç RPE katman ve sırayla RPE destek photoreceptor fizyoloji, sinirsel retinal atrofi ve vizyon kaybı3yol bozar temel Bruch’ın membran arasında “drusen” birikmesi ile ilişkili. 4,5. Şimdiye kadar tedavisi yok mu için Gelişmiş (neovasküler olmayan) AMD kuru. Kök hücre tedavisi rejeneratif tıp yeni bir paradigma olarak ortaya çıkması işlevsel olmayan ölü ya da diri RPE hücrelerinin sağlıklı hücrelere kök hücre kaynaklı yerine umut getiriyor. Nitekim, dikim geniş preklinik çalışmaları kök hücre (örneğin, insan embriyonik kök hücre)-türetilmiş RPE hücrelerinin RPE dejeneratif hayvan modelleri içine-si olmak be gerçekleştirilen6,7bazıları için ilerledi, klinik çalışmalarda8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Son zamanlarda, kök hücre insan RPE katmanda insan RPE kök hücreleri (hRPESCs), ikamet alternatif kaynağı bizim lab tarafından tespit edildi ve hRPESC türetilen-RPE hücre (hRPESC-RPE) ekimi tedavisi preklinik çalışmalarda AMD için kullanılmakta olan 10 , 11 , 12 , 13.
Subretinal enjeksiyon tekniği grubumuza dahil olmak üzere birden çok grubu tarafından yukarıda belirtilen preklinik çalışmalarda uygulanır. Hayvanlarda subretinal enjeksiyon için iki genel yaklaşım vardır: trans-vitreal ve trans-scleral. Trans-vitreal yaklaşım ön göz nüfuz eder, tüm vitreal kavite lens bitişik haçlar ve geri dön subretinal ulaşmak için göz retina nüfuz olarak doğrudan iğne sonuna gözlemlemek için güçlü olmak cerrah avantajı vardır alan14,15,16. Ancak, bu iki konum (anterior ve posteiror), retinada engellemeden objektifin zarar riski taşımaktadır ve iğne geri çektiği zaman içinde hücrelerin geri Vitre neden olabilir gerektirir. Buna ek olarak, trans-sklera yaklaşım, prensip olarak, retina ve camsı katılımı önler ve geri tepme göz çıkar. Pigmentli Rodents, cerrah başlangıçta sklera penetrasyonu gözlemleyebilirsiniz, ancak Pigmentli koroid içine geçiş sonra iğne sonunda artık görünmez. Olmadan doğrudan gözlem, retina ihlal yaygındır ve retina diseksiyon ve hücre ve/veya kan teslim Vitre içine neden olabilir. Ayrıca, göz yüzeyi kavisli çünkü hangi iğne açılardan ve derinliklerden trans-scleral enjeksiyonu için en etkili olduğunu bilmek çok zor.
Görüntülenmeyecektir bu makalede, biz bir trans-scleral subretinal enjeksiyon yöntemi ile optik Koherens ayrıntılı bir inceleme enjeksiyon yeri, sağlayan tomografi (OCT), ameliyat sonrası değerlendirme kullanımı haberdar tanıtmak. Bizim trans-scleral enjeksiyon tekniği tanımlanmış yerlere, açılardan ve derinliklerden enjeksiyon iğneler çok düşük cerrahi travma ve yüksek güvenilirlik üretmek için kullanır. Burada, özellikle hRPESC-RPE hücrelerinin enjeksiyon RCS sıçan, önceden klinik manken insan AMD subretinal boşluğa göstermektedir. Bu enjeksiyon yöntemi ile biz başarılı bir şekilde ve sürekli olarak hRPESC-RPE hücrelerinin RCS sıçan gözleri çok yüksek başarı oranı ile subretinal boşluğa teslim. Enjeksiyon hücrelerinin daha önce RCS photoreceptors korunması en az 2 ay sonra enjeksiyon13sonuç bulundu. Bu yordam diseksiyon mikroskop altında gerçekleştirilir ve öğrenmesi kolay. İki kişi (bir cerrah ve asistan) enjeksiyon gerçekleştirmesini gerektirir ve her hayvan için enjeksiyon zamanı ortalama 5 dakikadan daha az. Tanımlanmış açılardan ve derinliklerden enjeksiyon iğneler için OCT başarılı subretinal enjeksiyon ulaşmak kullanılamaz nerede laboratuarlar için mümkün kılar. Bu son derece tekrarlanabilir subretinal erişim sağlar ve sadece hücre transplantasyonu için ama aynı zamanda uyuşturucu teslim ve gen tedavileri için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede tasvir subretinal enjeksiyon tekniği nerede enjektör iğne sinirsel retina zarar veya vitreus kavite rahatsız olmadan göz duvar dış katmanlarını (sklera-koroid-RPE kompleksi) nüfuz trans-scleral yolu üzerinden gerçekleştirilir. Bir alternatif trans-vitreal yaklaşım objektif hasar kemirgenler objektif kaplayan vitreus kavite çoğunluğu bu yana katarakt için önde gelen bir potansiyel riski vardır. Bu yönteme göre bizim teknik daha az riskli ve enjektör iğne subretinal uzay ulaşmak için …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Patty Lederman RPE hücre hazırlık için cerrahi ve Susan Borden onu yardım için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca NYSTEM C028504 bu proje için finansman için kabul. D. Miller NIH tarafından desteklenen Justine F32EY025931 verin.
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
References
- De Jong, P. T. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 355, 1474-1485 (2006).
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ambati, J., Fowler, B. J. Mechanisms of agerelated macular degeneration. Neuron. 75, 26-39 (2012).
- Abdelsalam, A., Del Priore, L. V., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: Pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W. Age-related macular degeneration. N Engl J Med. 358 (24), 2606-2617 (2008).
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Embryonic stem cells and retinal repair. Mech Dev. 124 (11-12), 807-829 (2007).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt’s macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Blenkinsop, T. A., et al. Human adult retinal pigment epithelial stem cell-derived RPE monolayers exhibit key physiological characteristics of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7085-7099 (2015).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
- Davis, J. R., et al. Human RPE Stem Cell-Derived RPE Preserves Photoreceptors in the Royal College of Surgeons Rat: Method for Quantifying the Area of Photoreceptor Sparing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 304-309 (2016).
- Westenskow, P. D., et al. Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension. J Vis Exp. (95), e52247 (2015).
- Lopez, R., et al. Transplanted Retinal Pigment Epithelium Modifies the Retinal Degeneration in the RCS Rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (3), 586-588 (1989).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Nair, G., et al. Effects of Common Anesthetics on Eye Movement and Electroretinogram. Doc Ophthalmol. 122 (3), 163-176 (2011).
- McGill, T. J., et al. Transplantation of human central nervous system stem cells – neuroprotection in retinal degeneration. Eur J Neurosci. 35, 468-477 (2012).
- Al-Hussaini, H., Kam, J. H., Vugler, A., Semo, M., Jeffery, G. Mature retinal pigment epithelium cells are retained in the cell cycle and proliferate in vivo. Mol Vis. 14, 1784-1791 (2008).
- Wang, S., Lu, B., Wood, P., Lund, R. D. Grafting of ARPE-19 and Schwann Cells to the Subretinal Space in RCS Rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (7), 2552-2560 (2005).
- Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P. Induced corneal opacities in the rat. Br J Ophthalmol. 51 (2), 124-129 (1967).
