Desarrollo de un protocolo de refinado para Trans-escleral transplante Subretinal de células epiteliales del pigmento retiniano humano a ojos de rata

La retina humana situada en la parte posterior de las funciones del ojo como un tejido sensorial ligero y juega un papel fundamental en la percepción de la visión. Disfunción de las células retinianas o muerte de la célula por lo tanto causa problemas de visión o ceguera permanente. Enfermedades que implican degeneración o disfunción de las células en distintas capas de la retina se conocen como enfermedades retinianas degenerativas, entre las que AMD es el tipo más común y la principal causa de ceguera irreversible en los ancianos en los países desarrollados ^1,2. El proceso patológico de AMD está asociado con la acumulación de “drusen” entre la capa del EPR y membrana de Bruch subyacente, lo que deteriora a su vez apoyo RPE de la fisiología del fotorreceptor, llevando a la atrofia de retina neural y de pérdida de visión^{3, 4,5}. Hasta el momento, no existe cura para secar (no-neovascular) AMD. La aparición de la terapia de la célula de vástago como un nuevo paradigma en medicina regenerativa trae la esperanza de reemplazar las células RPE disfuncionales o muertas con células madre derivadas de células sanas. De hecho, estudios preclínicos de trasplante células (p. ej., células madre embrionarias) madre-derivado las células RPE en modelos animales RPE-degenerativas han sido realizados^6,7, algunas de las cuales han progresado a ensayos clínicos^8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Recientemente, una fuente alternativa de células madre residentes en la capa de EPR humana, las células RPE humanas (hRPESCs), fue identificada por nuestro laboratorio y en la actualidad se está utilizando en estudios preclínicos de terapia de trasplante de células (hRPESC-RPE) de RPE derivadas de hRPESC para AMD ^{10 , 11 , 12 , 13}.

La técnica de inyección subretinal es aplicada en los estudios preclínicos mencionados por varios grupos, incluyendo nuestro grupo. Hay dos enfoques generales para la inyección subretinal en animales: trans-vitreal y trans-escleral. El enfoque trans-vitreal tiene la ventaja del cirujano pudiendo observar directamente el extremo de la aguja penetra el ojo anterior, cruza la cavidad vitreal todo junto a la lente y penetra en la retina en la parte posterior del ojo para llegar a la subretinal espacio^14,15,16. Sin embargo, requiere interrumpir la retina en dos ubicaciones (anteriores y posteriores), conlleva el riesgo de dañar la lente y puede resultar en reflujo de células en el vítreo cuando la aguja se retrae. En contraste, el enfoque trans-esclerótica, en principio, evita la participación de la retina y vítreo y reflujo sale del ojo. En roedores pigmentados, el cirujano puede observar inicialmente penetración de la esclerótica, pero después paso a la coroides pigmentada, el extremo de la aguja ya no es visible. Sin observación directa, rompiendo la retina es común y puede producir disección retiniana y entrega de las células o sangre en el vítreo. Por otra parte, porque se curva la superficie del ojo, es muy difícil saber que aguja ángulos y profundidades son más eficaces para las inyecciones de trans-escleral.

En este artículo visualizado, presentamos un método de inyección subretinal trans-escleral por el uso de las evaluaciones post-quirúrgicos con tomografía de coherencia óptica (OCT), que permite un examen detallado del sitio de inyección. Nuestra técnica de inyección trans-escleral utiliza ubicaciones definidas, ángulos y profundidades de agujas de inyección producir trauma quirúrgico muy bajo y alta confiabilidad. Aquí, demostramos específicamente la inyección de las células de RPE hRPESC en el espacio subretinal de la rata RCS, un modelo preclínico de AMD humana. Con este método de inyección, con éxito y siempre entregamos las células RPE hRPESC en el espacio subretinal de ojos de ratas RCS con una tasa de éxito muy alta. Inyección de células fue encontrada para resultar en la preservación de los fotorreceptores RCS por lo menos 2 meses después de la inyección¹³. Este procedimiento se realiza con el microscopio de disección y es fácil de aprender. Se requieren dos personas (un cirujano y un ayudante) para realizar la inyección y el tiempo promedio de inyección para cada animal es menos de 5 minutos. Los ángulos definidos y profundidad para agujas de inyección hace posible para los laboratorios, donde el OCT está disponible, para lograr éxito inyección subretinal. Permite acceso subretinal altamente reproducible y puede ser utilizado no sólo para la célula, sino también de drogas entrega y gene terapias.