La manipulación de genes maternos funcional de Productos que utilizan<em> In Vitro</em> La maduración de ovocitos en el pez cebra

Todos pez cebra fueron manejadas en estricta conformidad con las buenas prácticas de los animales, según lo definido por los órganos de carácter nacional y / o local de los animales pertinentes, y todos los animales de trabajo fue aprobado por el comité correspondiente (Universidad de Wisconsin-Madison número aseguramiento A3368-01). Los animales se mantuvieron en condiciones estándar a 26,5 ° C. 1. Preselección de las hembras NOTA: Los oocitos en las hembras adultas típicamente abarcan una gama de etapas de desarrollo, a partir de la etapa I a V (Figura 2). Purgar las hembras de ovocitos preexistentes a través de un apareamiento natural con éxito aumenta la sincronización de puesta en escena de los ovocitos, como ovocitos recién en desarrollo aparecen como una cohorte 3, 14. Dentro de unos 8 días post-purga, la mayoría de los oocitos están en etapa IV temprano, lo cual es óptimo para la iniciación de la maduración in vitro. Tal sincronización aumenta el rendimiento de tha ovocitost puede pasar por el proceso completo de la maduración in vitro, lo que facilita la manipulación experimental. Ver descripciones previas 13 para más detalles sobre la configuración de los peces en los apareamientos pareados y en la composición del agua de pescado (aquí, 14 g de sal de mar y 150 g de NaHCO 3 por 1.000 l de agua de ósmosis inversa, pH 6.5 a 8.5 (intervalo preferido: 6,8 -7.5) y una conductividad de 180-360! S). Ver Brand et al. 13 para las recetas adicionales. De ocho a diez días antes de la manipulación de cultivo in vitro, utilizan una red de pesca para transferir un solo un solo pez macho y hembra de la cepa deseada a un tanque de apareamiento. Par de varios conjuntos. Dejarlos en la noche a la mañana tanque de apareamiento. Deje que se aparean durante la tarde y por la tarde del día siguiente. Utilice una red de pesca para separar las hembras que producen huevos durante el apareamiento y colocarlos en un tanque separado. Alimentar a estos hembras dos veces al día con una mezcla de alimentos containing aproximadamente una cantidad igual de camarón de salmuera y alimentos en escamas de pescado. La cantidad de comida debería ser suficiente para proporcionar aproximadamente 20 min, pero no más, de tiempo de alimentación. 2. Preparación de la maduración Medium NOTA: Preparar medio de maduración en el día del experimento la maduración in vitro, dentro de 1 h de la eliminación de los ovocitos de la hembra (véase la sección 3). Añadir 20 ml de medio L-15 de Leibovitz con L-glutamina, pH 7,0, a un tubo cónico de 50 ml en condiciones estériles. Llevar a pH 9,0 con NaOH 10 N. Añadir 9 ml de medio L-15 de Leibovitz, pH 9,0, a 2 tubos cónicos de 50 ml separados. Label 1 tubo "+ DHP" y el otro "-DHP." En el tubo de + DHP, añadir 10 l de 17α-20β-dihidroxi-4 pregnen-3-ona (DHP), 490 l de dH 2 O, y 500 l de 10% de albúmina de suero bovino (BSA). En el tubo de -DHP, añadir 100 l de 10 mg / ml de gentamicina, 40081; L de dH 2 O, y 500 l de 10% de BSA. 3. La disección de los ovocitos y la iniciación del cultivo in vitro NOTA: El experimento de cultivo in vitro se lleva a cabo con hembras preseleccionados 8-10 días después de que se liberan los huevos a través de apareamiento natural. Usar medio de maduración hecho el mismo día (véase la sección 2). Ovocitos maduros apropiadamente si la disección se inicia cerca del final del ciclo diurno de pescado (determinado en el laboratorio mediante iluminación artificial pre-establecido en la instalación de pescado) 13, posiblemente procesos que ocurren a través de apareamiento natural imitando. Esto implica que la mayoría de los pasos en el protocolo deben llevarse a cabo en la noche si los peces se alojaron en una instalación con un ciclo de luz estándar (por ejemplo, a partir de la etapa 3.2 a 18:00 en una instalación con un período de luz 08 a.m.-10 p.m.), aunque otros trabajo periodos de tiempo son posibles con un ciclo de luz apropiadamente desplazado en el tiempo. Preparar una solución de tricaína de stock 0,2% en dH 2 O, tamponada a pH 7,0 con 1 M Tris, pH 9,0, y mantener esta solución a 4 ° C. Esto puede ser preparado de antemano. Iniciar la h experimento 0-4 antes del final del ciclo diario de luz en la instalación. En un vaso de precipitados de 250 ml, añadir 20 ml de 0,2% de solución de tricaína Stock, pH 7,0, a 80 ml de agua pescado y mezclar. La transferencia de las hembras pre-seleccionado para la solución tricaína y la eutanasia por la sobreexposición. Deja las hembras en la solución tricaína durante 15 minutos después del cese de movimiento gill. Con una cuchara, recoger los peces sacrificados de la solución tricaína y enjuagar brevemente en agua los peces. Coloque el pescado en una toalla de papel para absorber el exceso de agua. Utilice una hoja de afeitar limpia para decapitar a los peces sacrificados en el plano de la aleta pectoral. Usando tijeras de disección, hacer una incisión longitudinal en el lado ventral de los peces, que se extiende desde el extremo anterior de la zona anal. <li> Colocar el pescado en una placa de Petri con un microscopio de disección con luz incidente. El uso de un par de fórceps de disección, transferir porciones de ovario a una placa de cultivo mm 35 x 10 que contenía 4 ml de medio L-15 de Leibovitz + DHP. NOTA: Los ovarios, que contienen los ovocitos en desarrollo, aparecerán como estructuras opacas y clumpy dentro de la cavidad interna del cuerpo. Con unas pinzas de disección, disociar suavemente los ovocitos foliculares de las masas. Ordenar la primera etapa IV ovocitos (Figura 2B; anteriores a la ruptura GV, en tamaño casi máxima y se caracteriza por un citoplasma oscuro, opaco y un fácilmente evidente GV situado asimétricamente dentro del ovocito). Desechar los oocitos en las etapas anteriores (Figura 2A) y, huevos etapa V maduras translúcidos (similares a los de la Figura 2C, pero presente en los ovarios antes del tratamiento DHP). NOTA: Los ovocitos se seleccionan para la maduración en la etapa IV temprano, la etapa más temprana que resulta en madura, oocyt etapa Ves después de las condiciones de cultivo in vitro (Figura 2C y D) 3. Debido a ovocitos en estadio IV están produciendo activamente los productos, la manipulación en esta etapa permite la expresión de productos exógenos a través de la inyección de ARN o para la reducción de la función de genes a través de OMs introducidas. Usar una pipeta Pasteur de vidrio para transferir los ovocitos primeros estadio IV a una segunda placa de cultivo de plástico mm 35 x 10 que contenía 4 ml de medio L-15 de Leibovitz + DHP. Transferencia de cantidades mínimas de medio -DHP al plato que contiene la solución + DHP. 4. La microinyección de ovocitos NOTA: etapa Aislado IV ovocitos sometidos a la maduración in vitro se pueden microinyectaron para introducir reactivos para la manipulación funcional o expresión de la proteína etiquetada. La microinyección de reactivos, tales como mRNA y Mos (ver sección 4), se lleva a cabo típicamente cuando los oocitos están experimentando in vitro maturación en medio + DHP, antes de defolliculation. Si se desea, con el fin de permitir más tiempo para llevar a cabo las manipulaciones antes de la maduración de ovocitos, las inyecciones pueden también llevarse a cabo en medio -DHP, antes de la maduración, durante al menos 2 h. Posteriormente, pueden ser transferidos a medio + DHP. Preparar los ARNm utilizando un kit de expresión estándar. Mantenerlos a -80 ° C como una 100-500 pg / l de stock para inyección a una concentración final de 50-500 pg / l (200 pg / l se recomienda) en agua RNA-grado. Preparar OMs a una concentración de 4 ng / l en agua de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Inyectarlos a concentraciones finales de 2 ng / l (o según se determina empíricamente). NOTA: Las inyecciones se llevan a cabo típicamente en un medio + DHP antes de defolliculation (véase la nota en la sección 5). Si la inyección de ARNm, inmediatamente antes de la inyección, se diluye la ARNm utilizando agua-ósmosis inversa de ARN-grado y 0,2 M KCl para conseguir una solución final de 0,1 M KCl. Si la inyección de MOS, inmediatamente antes de la inyección, se diluye la OMs a la concentración deseada con agua-ósmosis inversa y 0,2 M KCl para conseguir una solución final de 0,1 M KCl. Mantener manualmente ovocitos con unas pinzas finas e inyectar aproximadamente 1 nL en de tipo salvaje ovocitos etapa IV con una aguja hecha con una pipeta capilar de vidrio desmenuzado. Preparar las agujas de vidrio tirando de tubos capilares de vidrio calentada, la carga de la solución a inyectar, y romper la punta de la aguja con un fórceps, tal como se describe anteriormente en protocolos de inyección estándar en embriones de pez cebra primeros 15. Nota: Es útil si la aguja tiene una conicidad gradual en lugar de un abrupto uno; Esto permite más flexibilidad en términos de la ubicación de la rotura en la punta de la aguja y también ayuda a evitar daños en el embrión inyectado. Usando la misma aguja y la solución como para las inyecciones de embrión, ajustar el volumen inyectado por pre-determinar elajustes de presión microinyector que producen el volumen deseado. Estos ajustes pueden ser determinados por-mock inyectar en una gota de aceite mineral sobre un portaobjetos de calibración platina del microscopio (0,01 mm) y el ajuste de la configuración de micro inyector para obtener el diámetro deseado en el bolo de solución inyectada, como se ha descrito previamente 15. 5. La maduración de ovocitos y Defolliculation NOTA: Durante la maduración de ovocitos, los ovocitos serán cada vez más transparente, lo que permite la evaluación de las condiciones de cultivo exitosas. Continuar la incubación de la inmaduro (y, si es apropiado, inyectado) ovocitos en medio + DHP en 26,5 ° C, comprobando periódicamente (cada 30 min) para asegurar que los oocitos permanecen intactas y son sometidos a maduración adecuada al convertirse en progresivamente translúcido (véase la figura 2C) . Eliminar cualquier ovocitos de lisis con una pipeta Pasteur y desecharlosen un vaso de precipitados de residuos de laboratorio para mantener la calidad del medio. Cambiar el medio de cultivo con aproximadamente una mitad de volumen de fresco + medio DHP para mantener una solución clara, dependiendo de la cantidad de lisis de oocitos. Dejar que la maduración in vitro de proceder hasta que una mayoría de los ovocitos ser translúcido y tienen un GV que ya no es aparente (aproximadamente 2 h en el tratamiento DHP, ver Figura 2C, en comparación con D). Verlas bajo un microscopio de disección con óptica de luz transmitida. Retire la membrana folicular más exterior de cada ovocito madurado. El uso de fórceps extrafinos para hacer un desgarro en la membrana folicular en una región con un mayor espacio entre el ovocito y la membrana. Despegar una porción de la membrana y rodar el ovocito fuera de la membrana mientras mantiene pulsada la parte pelada. NOTA: La membrana coriónica subyacente típicamente se mantendrá en estrecha asociación con el huevo durante este proceso; después de acto de huevoivation, se expande para formar una capa protectora para el embrión. La transferencia de los ovocitos desfolicularon en un volumen mínimo de medio (normalmente, la transferencia de unos 5-10 ovocitos maduros en menos de 20! L) a una placa de Petri con unas pocas gotas de cultivo (+ DHP) medio y proceder a la fertilización. 6. La fertilización in vitro de oocitos cultivados NOTA: La solución de esperma en hielo, preparado a continuación, mantendrá su potencia durante aproximadamente 2 h. Preparar una solución de esperma cerca del final de la etapa de maduración de ovocitos y antes de defolliculation utilizando testículos de cinco machos en 500 l de solución de Hanks, como se ha descrito previamente 16, 17. Añadir 10-50 l de solución de esperma a los ovocitos desfolicularon en medio de cultivo + DHP. Espere 10 s. Con una pipeta, añadir unas gotas de embriones (E3) medio de los ovocitos. Espere 1 min y luego inundar el plcomió con medio E3. NOTA: La composición del medio de E3 es el siguiente: NaCl 5 mM, KCl 0,17 mM, 0,33 mM de CaCl2, 0,33 mM MgSO4, y 1-5% de azul de metileno 13. Repetir los pasos 5.3, 6.2, y 6.3 para obtener un mayor número de embriones fertilizados. Permita que los embriones fertilizados se desarrollen. Utilice un microscopio de disección con óptica de luz transmitida para observar la progresión a través de las etapas de escisión para garantizar la fertilización con éxito, como se describe anteriormente para la fertilización 17 y puesta en escena 18.