Deniz Bakterileri ile Ekotoksikolojik Yöntem<emVibrio anguillarum</em> Çevresel Kirleticilerin Akut Zehirliliğini Değerlendirmek
Summary
Bu çalışma, kirleticilerin ekotoksisitesini değerlendirmek için nanomalzemeler gibi gelişmekte olan bulaşıcılar da dahil olmak üzere deniz bakterisini Vibrio anguillarum kullanarak yeni bir protokolü açıklamaktadır . Bu yöntem, LC 50'nin veya 6 saatlik maruz kaldıktan sonra bakteri kültürlenebilirliğinde% 50 azalmaya neden olan ölüm konsantrasyonunun belirlenmesine izin verir.
Abstract
Bakteriler ekosistemin önemli bir bileşenidir ve mikrobik topluluk değişiklikleri biyojeokimyasal bisiklet ve gıda ağları üzerinde önemli bir etkiye neden olabilir. Mikroorganizmalara dayanan toksisite testleri nispeten hızlı, tekrarlanabilir, ucuz ve etik konularla ilişkili olmadığı için yaygın olarak kullanılır. Burada, deniz bakterisi Vibrio anguillarum'un biyolojik cevabını değerlendirmek için bir ekotoksikolojik yöntem tarif ediyoruz. Bu metot, nanoparçacıklar gibi yeni kirleticiler ve çevresel numuneler de dahil olmak üzere kimyasal bileşiklerin akut toksisitesini değerlendirir. Bitki noktası, toksik maddeye maruz kalma nedeniyle bakteri kültürlenebilirliğinin azaltılması ( yani, koloni çoğaltma ve biçimlendirme kabiliyeti) 'dir. Bu azalma genel olarak ölüm oranı olarak adlandırılabilir. Test, LC 50'yi , aktif olarak replike olan ve kolonileri oluşturan bakterilerin% 50 azalmasına neden olan konsantrasyonun saptanmasına izin verir;6 saat boyunca maruz kaldım. Kültürlenebilir bakteriler, koloni oluşturma üniteleri (CFU) bakımından sayılır ve "ölüm oranı" kontrol edilir ve kontrol ile karşılaştırılır. Bu çalışmada bakır sülfatın (CuSO 4 ) toksisitesi değerlendirildi. Üç bağımsız testten sonra, ortalama LC 50 1.13 mg / L ile açık bir doz-yanıt ilişkisi gözlemlendi. Bu protokol, mikroorganizma ile mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında, daha geniş bir tuzluluk aralığında uygulanabilir ve renkli / bulanık numuneler için herhangi bir sınırlama yoktur. Araştırılan kirleticilerle büyüme ortamının muhtemel etkileşimlerinden kaçınarak, maruz bırakma ortamı olarak tuz çözeltisi kullanır. LC 50 hesaplaması, deniz çevresinin ekotoksikolojik değerlendirmelerine sıkça uygulanan diğer biyolojik tahliller ile karşılaştırmayı kolaylaştırır.
Introduction
Ekotoksikolojik biyolojik tahliller, standart biyolojik modellerle kimyasalların veya çevresel numunelerin toksisitesini değerlendirir, fiziksel, kimyasal ve biyolojik stresörlerin ekosistemler üzerindeki etkilerini bütünleştirir. Ekosistemlerin karmaşıklığı nedeniyle, ekotoksikolojik risk değerlendirmeleri, farklı trofik seviyelerdeki organizmaları içeren bir biyoanaliz testi düşünmelidir. Laboratuvar hayvanları üzerindeki toksisite testleri pahalı, zaman alıcı ve etik açıdan şüpheli olabilir. Hayvan testlerini sınırlandırmak ve alternatif yaklaşımlar geliştirmek ( örneğin, bakteriler ve omurgalı olmayan hayvanlar üzerinde), mevcut AB mevzuatı çerçevesinde bildirilen ve AB Hayvanları Koruma Direktifi, Madde 7'deki Değişiklikler AB Kozmetik Direktifi ve REACH.
Kabuklular, balıklar ve algler, deniz ortamında toksisite ölçümleri için büyük oranda kullanılır 1 . Bakteriler önemli bir bileşenEkosistemin ve mikrobik topluluklardaki değişikliklerin biyojeokimyasal döngü ve diğer kritik ekosistem hizmetleri üzerinde önemli etkileri olabilir. Mikroorganizmalara dayanan toksisite testleri, nispeten hızlı, çoğaltılabilir ve ucuz oldukları ve etik sorunları ortaya koymadığı için popülerlik kazanmaktadırlar 2 . Bu çalışmanın amacı, çevre kirleticilerine maruz bırakıldığında deniz bakterisi Vibrio anguillarum'un ( Listonella anguillarum, Vibrionaceae) cevabını değerlendirmek için bir ekotoksikolojik protokolün tanımlanmasıdır.
V. anguillarum , polar lekeli bir Gram-negatif, kısa, eğri şeklinde çubuk bakteri (0.5 x 1.5 μm) 'dir. Kabuklu su veya tuzlu suda tipik olarak bulunan, yaklaşık 20 ° C'lik bir optimum tuzluluk derecesine ve 25 ° C ile 30 ° C3 arasında en uygun sıcaklığa sahip halotoleranttır. Yaygın olması ve önemli ekolojik rolleri nedeniyle organizma modeli olarak seçilmiştir.Dünya çapında 4 . V. anguillarum'un bazı serotiplerinin, çeşitli denizel ya da acayip balık türlerinde 5 , 6 vibriozise neden olduğu bilinmektedir. Bunun için deneyin bazı aşamaları standart mikrobiyolojik uygulamalar gerektirir, ancak herhangi bir özel güvenlik teçhizatı veya önlem gerekmez. Önerilen toksisite test protokolü, son nokta olarak bakteri kültürlenebilirliğini ( örn. , Replikasyon ve kolonileri oluşturma kabiliyeti) kullanır ve aktif olarak replike olan ve kolonileri oluşturan bakterilerin% 50 azalmasına neden olan konsantrasyonun LC 50'yi belirlemesine izin verir; 6 saatlik maruz kalma. Vibrio'da, diğer mikroplarda olduğu gibi, genel olarak ölüm oranı olarak gösterdiğimiz bu azalma kısmen, yaşanabilir ama kültürsüz olmayan (VBNC) faz 7'deki bireylerden kaynaklanabilir. Bu çalışmada, bu metodu, bakır sülfatın (CuSO 4), Bir referans toksik madde.
Bu yöntem, nanomalzemeler gibi ortaya çıkan kirleticiler de dahil olmak üzere kirleticilerin / kimyasal bileşiklerin ekotoksik değerlendirilmesi için uygun bir mikroorganizma temelli test sağlamak üzere geliştirilmiştir. Bu protokolün, mikroorganizmalar için kullanılan mevcut yöntemlere kıyasla yeniliği esas olarak maruz kalma aracı ve son nokta ile ilgilidir. Aslında, maruziyet, büyüme ortamının biyolojik cevabı etkileyebilecek araştırılan kirleticilerle olası herhangi bir etkileşiminden kaçınarak salin solüsyonu içinde gerçekleştirilir 8 . Son nokta bakteri kültürlenebilirliğinin azalmasıdır; bu, bakteri / ekşi ortamlarda ektotoksikolojik tarama için kullanılan hayatta kalma / ölüm oranına dayalı diğer akut sonlanım noktalarıyla kolayca karşılaştırılabilir. Üstelik, protokol hacimleri azaltarak E. coli 9 üzerinde zaten kullanılan likit-plakalı mikro sayım tekniklerini kullanır ve böylece deneysel eff(Ayrıntılar için protokolün 3.3 ve 3.4 adımlarına bakınız).
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, referans toksikant olan CuSO 4'ün toksik etkilerini değerlendirmek için başarılı bir şekilde uygulanan deniz bakterisi V. anguillarum'la yeni bir biyolojik tahlil açıklamakta olup, açık bir doz-tepki ilişkisi sergilemektedir. Deniz bakterisi V. anguillarum , haloolerant, her yerde bulunan ve deniz ekosistemlerinin temsilcisi olduğu için model organizma olarak seçilmiştir.
Test, geniş bir tuzluluk değerleri aralığında (5-40) gerçekleştirilebilir ve mikroorganizmaların tüm test süresince kolayca kurtulabildiği sürece, salma solüsyonlarını ve maruz kalma ortamı olarak sentetik veya doğal deniz suyunu kullanabilir. Bu, acayip ve deniz ortamları da dahil olmak üzere farklı türde numunelerin analiz edilmesini sağlar.
Maruz kalma aşamasında kirletici maddeler 8 ile olan etkileşiminden ve biyolojik tepki üzerindeki muhtemel etkisinden kaçınmak için büyüme ortamı gerekmez. thE protokolü güvenilir, hızlı, düşük maliyetli ve nispeten kolaydır. Sıvı-plakalı mikro sayımlar 9'un prosedürü, küçük (örnek) hacimlerin kullanılmasının avantajını sağlar, ancak bu, yüksek bir doğruluk derecesi ve sağlamlık anlamına gelmektedir. Her bir tedavi için üç bağımsız deneme ve tekrarın sonuçları, bu yöntemin yüksek tekrar edilebilirliğini göstermektedir. Bakterinin biyolojik bir model olarak kullanılması ve tekniğin uyarlanabilirliği, bu prosedürün ekolojik ve çevresel önemini desteklemektedir. Diğer kritik teknik konular, bakteriyel inokülumun hazırlanmasında ve prosedürün bazı adımlarında gerekli olan kısırlığa hassasiyettir.
Önerilen test, diğer deniz ekotoksikolojik testlerinden (24-96 saat) daha hızlıdır (6 saat) ve daha yüksek organizmaların kullanımından kaynaklanan etik sorunlara yol açmaz. Ayrıca, referans toksikant üzerine ilişkin veriler, akut t ile elde edilenlerle karşılaştırılabilir LC 50 değerlerini göstermektedir Diğer deniz türleri üzerinde 10 , 11 , iyi bir hassasiyet sergilediğini belirtir. Bakteriyel biyolojik tahliller arasında, V. fischeri lüminesans inhibisyon testi en yaygın ve iyi standardize edilmiş 12 . Bu biyolojik tahlil çok hızlıdır (15-30 dakika) ve katı fazlı numunelerin test edilmesi için geçerlidir, ancak lüminesans ölçümlerine müdahale eden renkli ve bulanık örneklerden etkilenebilir. Tuzluluk, yukarıda bahsedilen testin kullanımındaki sınırlayıcı bir faktördür ve% 2 NaCl gerekir 13 . Aksine burada V. anguillarum ile önerilen test, geniş bir tuzluluk değerleri aralığında uygun sonuçlar verir, bulanık veya renkli numuneler için herhangi bir sınırlama getirmez ve parlaklık analiz cihazlarına kıyasla daha az pahalı ekipman gerektirir. Çalışmamızın sonuçları ile V. fisheri'nin literatürdeki sonuçları arasında bir karşılaştırma 14 ,Ss = "xref"> 15 , 16 karşılaştırılabilir EC 50 değerlerini gösterir ve bu biyolojik tahlilin etkinliğini de destekler.
Bu biyolojik tahlil, şu anda mikroorganizma için mevcut olan testlerde kullanılan popülasyon büyüme oranı veya enzimatik aktivite inhibisyonu yerine, genellikle mortalite olarak adlandırılan bakteri kültürlenebilirliğinin azaltılmasını değerlendirir. LC 50 hesaplaması, genellikle deniz seviyesinin ekotoksikolojik değerlendirmesine uygulanan ve genellikle bitki noktası olarak hayatta kalma / ölüm oranına sahip olan diğer biyolojik tahliller ile karşılaştırılmasını sağlar. Bu testin güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini değerlendirmek / onaylamak ve standardizasyonunu ve düzenleyici protokollerde kullanılmasını desteklemek için intercalibration uygulaması yapılması acilen gereklidir.
Nanomalzemelerin artan kullanımı ve çevredeki potansiyel salınımı, risk değerlendirmesi ihtiyacını işaret etmektedir 17 . Ancak, klasOrtaya çıkan bu kirleticiler için sical (eko) toksikolojik yaklaşımlar uygun fiyatlı sonuçlar vermez ve bazı adaptasyonlar gerektirebilir 18 . Bu yeni biyolojik tahlilin özellikleri, nanoparçacıkların toksisite değerlendirmesine kolay ve kullanışlı bir uygulama yapmasını sağlar. Aslında, farklı salinities'de tahlil yapma imkanı, toksisiteyi önemli ölçüde etkileyebilen, çevresel bir parametre değişkeni olan farklı iyonik kuvvetler altında nanoparçacık davranışı hakkında bilgi verecektir 19 . Ayrıca organik maddeler toksik etkileri 20 arttırarak absorpsiyonunu kolaylaştırabildiği veya agregaya neden olabileceği, biyoyararlanabilen fraksiyonu ve dolayısıyla toksisitesini düşürebileceği için, büyüme ortamı ve besin maddeleri kullanımına özellikle nanoparçacıkların ekotoksisite değerlendirmelerinde önerilmemektedir21.
Sonuç olarak, Vibrio anguillarum üzerindeki biyolojik tahlil apKlasik ve ortaya çıkan kirleticilerin risk değerlendirmesi için kullanılan romantizm aracı, ayrıca deniz ve tuzlu ortamların durumunun değerlendirilmesi için.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, araştırma projesi tarafından finanse edildi: "NanoBioTech ortamı, Progetto 2: Ambiente, Biyo -Teknoloji Teknolojisi: Çevre ve Sağlık Projesi 2: Çevre" Ekotoksikolojik Araçlar ve Yöntemleri Nanopartiküllerin izlenmesi " ) Lazio-Consorzio Hypatia Bölgesi'nden LM'ye verilmiştir. AR, daha önce belirtilen proje çerçevesinde Tor Vergata / Regione Lazio-Consorzio Hypatia Üniversitesi'nden doktora sonrası hibe ile finanse edildi. ISPRA-Tor Vergata Üniversitesi (N. 2015/52857) ile yapılan bir anlaşma, tesislerin karşılıklı kullanımına ve araştırmacıların değişimine izin verdi.
Yazarlar, tüm mikrobik faaliyetler için koruyucu meleğimiz olan Prof. Maria Cristina Thaller'e, mikrobik dünyaya ilgi duyma ve konuyla ilgili araştırmalarımızı iyileştirmeye büyük katkılarından dolayı borçluyuz. Yazarlar Andrea Tornambè ve Eri'yi minnetle kabul ettilerKa Magaletti, Fitoplankton ekolojisi ve ekotoksikoloji ile ilgili ISPRA Laboratuarı ile değerli işbirliği için.
Materials
| Vibrio anguillarum (strain AL 102, serotype O1) | Obtained from the laboratory collection of NOIFMA (Norway) | ||
| Tryptic Soy Agar | Liofilchem | 610052 | Dehydrated Culture Media |
| Tryptic Soy Broth growth medium | Liofilchem | 610053 | Dehydrated Culture Media |
| CuSO4 ·5H2O | Sigma-Aldrich | 209198 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S-3014 | |
| Name of Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Biosafety Laminar Flow Hood | ESCO | ||
| Incubator | Fratelli Galli | Mod. 2100 | |
| Name of Software | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Benchmark Dose Software | US EPA | Benchmark Dose 2.4.0 | 2012 |
References
- Parvez, S., Venkataraman, C., Mukherji, S. A review on advantages of implementing luminescence inhibition test (Vibrio fischeri) for acute toxicity prediction of chemicals. Environm. Internat. 32 (2), 256-268 (2006).
- Rad, M., Shahsavani, D. Isolation and characterization of Vibrio (Listonella) anguillarum from catfish. Turkish J. Veter. Animal. 34 (4), 413-415 (2010).
- Thompson, F., Iida, T., Swings, J. Biodiversity of Vibrios. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68, 403-431 (2004).
- Austin, B., Austin, D. A. Vibrionaceae representatives: characteristics of the disease. Bacterial Fish Pathogens: Disease of Farmed and Wild Fish. 29-30, 108-115 (1999).
- Larsen, J. L., Mellergaard, S. Microbiological and hygienic problems in marine aquaculture: furunculosis and vibriosis in rainbow trout (Salmo gairdneri). L.). Bull. Eur. Assoc. Fish Pathol. 1, 29-31 (1981).
- Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria. J. Microbiol. 43 (1), 93-100 (2005).
- Hsieh, C. -. Y., Tsai, M. -. H., Ryan, D. K., Pancorbo, O. C. Toxicity of the 13 priority pollutant metals to Vibrio fisheri in the Microtox chronic toxicity test. Sci. Total Environ. 320, 37-50 (2004).
- Migliore, L., Rotini, A., Thaller, M. C. Low doses of Tetracycline trigger the E. coli growth: a case of hormetic response. Dose-Response. 11, 550-557 (2013).
- Adams, M. S., Stauber, J. L. Development of a whole-sediment toxicity test using a benthic marine microalga. Environm. Toxicol. Chem. 23 (8), 1957-1968 (2004).
- Manfra, L., et al. Ecotoxicity of diEthylene Glycol and risk assessment for marine environment. J. Hazard. Mat. 284, 130-135 (2015).
- . . Microtox® Acute Toxicity Solid-Phase Test. , 20 (1995).
- . Metodi analitici per le acque. Manuali e Linee Guida (Analytical methods for waters. Manual and Guidelines). Metodi Ecotossicologici (Ecotoxicological methods). 29 (3), 8030 (2003).
- Heinlaan, M., Ivask, A., Blinova, I., Dubourguier, H. -. C., Kahru, A. Toxicity of nanosized and bulk ZnO, CuO and TiO2 to bacteria Vibrio fischeri and crustaceans Daphnia magna and Thamnocephalus platyurus. Chemosphere. 71, 1308-1316 (2008).
- Mortimer, M., Kasemets, K., Heinlaan, M., Kurvet, I., Kahru, A. High throughput kinetic Vibrio fischeri bioluminescence inhibition assay for study of toxic effects of nanoparticles. Toxicol. In Vitro. 22 (5), 1412-1417 (2008).
- Bondarenko, O. M., et al. Multilaboratory evaluation of 15 bioassays for (eco) toxicity screening and hazard ranking of engineered nanomaterials: FP7 project NANOVALID. Nanotoxicology. 10 (9), 1229-1242 (2016).
- Matranga, V., Corsi, I. Toxic effects of engineered nanoparticles in the marine environment: model organisms and molecular approaches. Mar. Envir. Res. 76, 32-40 (2012).
- Corsi, I., et al. Common strategies and technologies for the ecosafety assessment and design of nanomaterials entering the marine environment. ACS NANO. 8 (10), 9694-9709 (2014).
- Handy, R. D., von der Kammer, F., Lead, J. R., Hassellöv, M., Owen, R., Crane, M. The ecotoxicology and chemistry of manufactured nanoparticles. Ecotoxicology. 17, 287-314 (2008).
- Kasemets, K., Suppi, S., Kunnis-Beres, K., Kahru, A. Toxicity of CuO nanoparticles to yeast Saccharomyces cerevisiae BY4741 wild-type and its nine isogenic single-gene deletion mutants. Chem. Res. Toxicol. 26, 356-367 (2013).
- Ivask, A., et al. Mechanisms of toxic action of Ag, ZnO and CuO nanoparticles to selected ecotoxicological test organisms and mammalian cells in vitro: A comparative review. Nanotoxicology. 8 (1), 57-71 (2013).
