生物毒理学方法与海洋细菌<em>鳗弧菌</em>评估环境污染物的急性毒性

1.试剂/材料的制备准备（约300）无菌1.5 mL管，用于连续稀释细菌悬浮液，以及15 mL无菌管作为测试浓度标记的测试容器。 准备2％NaCl溶液作为曝光介质并灭菌。或者，使用灭菌的合成或天然海水，盐度范围为5至40。 根据标签方向准备具有2％NaCl的胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）生长培养基，并考虑培养基中已经存在的NaCl量。 将TSA（冷却但仍然是液体的）倒入以前用测试浓度和暴露时间，重复数量和稀释因子标记的90-mm培养皿中; 19 mL是适当的体积。 根据标签方向制备胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）生长培养基。加入适量的NaCl以获得与曝光介质相同的盐度。 准备具有双蒸水的CuSO 4储备溶液，并使用0.22μm注射器过滤器消毒（必需）等分试样。在环境样品的情况下，准备适当的样品稀释间隔，并使用0.22μm注射器过滤器进行灭菌。 在测试浓度标记的15 mL管中制备测试溶液。用5 mL曝光介质（2％NaCl）填充阴性对照。用适量的暴露介质和CuSO 4储备液填充其他管，以获得最终体积为5 mL的测试浓度。 细菌接种物制备试验前12-18 h，制备鳗弧菌液体新鲜培养物。使用无菌环，从固体培养基（TSA）上的过夜培养中选择一个单独的，分离良好的菌落。接种填充有10mL TSB的管，并将细菌培养物在25℃下孵育12-18小时。 </li> 12-18小时后，用分光光度法估计接种物的细菌浓度。涡旋接种物并测量600 nm波长的光密度，使用TSB作为空白。 为了获得已知的细菌浓度，通过加入通过以下公式计算的TSB量稀释2mL的涡旋接种物： TSB mL = [（OD / 0.14）* 2] -2。 验证稀释接种物的光密度是0.140（±0.005），这对应于麦克法兰德比浊法标准的0.5分。 将稀释的接种物以3,000g离心10分钟。消除上清液并将微生物沉淀物重新悬浮在1mL的2％NaCl溶液（曝光介质）中。 3.测试曝光加入150μL重悬细菌接种物到每个管，包括对照。在黑暗和连续条件下，在25℃下孵育鳗弧菌悬浮液6小时摇晃以避免沉淀。 在暴露时间的开始（T 0 ）和结束（T 6 ），使用菌落形成单位（CFU）计数法在所有暴露的细菌悬浮液中进行细菌计数。 准备连续稀释每种暴露的细菌悬浮液一式三份，应用十倍稀释因子（最多10 -5 ）。将100μL每个细菌悬浮液加入到已经填充有900μL曝光介质（2％NaCl）的相应管中。继续进行连续稀释，每个步骤涡旋以重新悬浮细菌。 在对应的片段中的TSA培养皿上10μL的10 -4和10 -5稀释液。通过旋转盘子快速让液滴滑入一个小圆圈。将板在25℃孵育48小时。 4. CFU计数 48小时后，计数在培养皿上生长的菌落;藏有b的盘子5和50个菌落是准确计数的最佳选择。 通过应用以下公式计算每毫升暴露的每个细菌悬浮液的活细菌数： 10 -4 →CFU / mL = n°CFU×100×10,000 10 -5 →CFU / mL = n°CFU×100×100,000 使用并行重复获得的计数的平均值来评估与对照相比的死亡率。以下列公式计算死亡率百分比： M％= 100 – [（N / C）* 100] 注意：其中N =暴露于毒物后生长的CFU / mL数; C =在对照培养基中生长的CFU的数量。 使用适当的统计软件（参见材料表），使用非线性回归分析计算LC 50 （ 即，将活性复制细菌数量减少50％/ mL的CFU / mL）。运行单向方差分析（ANOVA）通过事后成对t检验来评估治疗之间的显着差异。