Un método de montaje versátil para largo plazo de imágenes de Desarrollo de pez cebra
Summary
Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.
Abstract
embriones de pez cebra ofrecen un sistema experimental ideal para estudiar los procesos morfogenéticos complejos debido a su facilidad de acceso y la transparencia óptica. En particular, la elongación posterior del cuerpo es un proceso esencial en el desarrollo embrionario mediante el cual múltiples deformaciones de tejido actúan juntos para dirigir la formación de una gran parte del eje del cuerpo. Con el fin de observar este proceso mediante formación de imágenes de lapso de tiempo a largo plazo, es necesario utilizar una técnica de montaje que permite un apoyo suficiente para mantener las muestras en la orientación correcta durante la transferencia al microscopio y de adquisición. Además, el montaje también debe proporcionar la suficiente libertad de movimiento para la derivación de la región posterior del cuerpo sin afectar su desarrollo normal. Por último, debe haber un cierto grado de versatilidad del método de montaje para permitir la formación de imágenes en diversas imágenes set-ups. A continuación, presentamos una técnica de montaje para obtener imágenes del desarrollo de elongatio posterior del cuerpon en el pez cebra D. rerio. Esta técnica consiste en embriones de tal manera que las regiones de la cabeza y del saco vitelino son casi en su totalidad incluidos en agarosa de montaje, dejando fuera de la región posterior del cuerpo para alargar y desarrollarse normalmente. Vamos a mostrar cómo esto puede ser adaptado para su posición vertical, invertida y vertical de la ficha técnica de microscopía de luz montajes. Si bien este protocolo se centra en los embriones para obtener imágenes de la parte posterior del cuerpo de montaje, que podría adaptarse fácilmente para la formación de imágenes en vivo de varios aspectos del desarrollo del pez cebra.
Introduction
Posterior elongación cuerpo es un proceso esencial en el desarrollo embrionario en la que el embrión se extiende para formar una gran parte del eje del cuerpo. Es un ejemplo de un proceso morfogenético complejo mediante el cual múltiples comportamientos celulares actúan coordinadamente para generar la morfogénesis en el nivel de los tejidos individuales. Estas deformaciones de tejido diferencial entonces actúan juntos para generar el alargamiento del cuerpo posterior en todo el nivel de la estructura. Para entender cómo estos procesos son controlados y coordinados durante el desarrollo, debemos ser capaces de seguir estos procesos en múltiples escalas (es decir, en el nivel de moléculas, células, las poblaciones de células y tejidos) y relacionar esto directamente a la morfogénesis de toda la estructura .
embriones de pez cebra son ideales para la elongación posterior del cuerpo de imagen como su transparencia óptica y pequeño tamaño permite la aplicación de impresión débil mínimamente invasiva enfoques adecuados para live imágenes. 1 Esto se ha evidenciado por una serie de publicaciones recientes que han arrojado luz sobre el desarrollo posterior del cuerpo a nivel de moléculas, 2 células individuales, 3 e inter-tejido comportamientos, 4, así como a nivel de la población de células y órganos en general. 5
Las técnicas de imagen avanzadas, como confocal, microscopía multifotónica y el plano selectiva microscopía de iluminación (SPIM) están permitiendo la formación de imágenes a largo plazo de los procesos de desarrollo, con una disminución del efecto de la toxicidad de la luz y foto-blanqueo. se requieren técnicas robustas para el montaje de muestras vivas para lograr tres objetivos: 1) el apoyo suficiente para mantener las muestras en la orientación correcta durante la transferencia al microscopio y durante la adquisición, 2) la suficiente libertad de movimiento de la muestra para permitir la derivación de la región posterior del cuerpo sin afectar a su desa normalesrrollo y, finalmente, 3) un cierto grado de versatilidad del método de montaje para permitir la formación de imágenes en diversas imágenes montajes.
Este protocolo presenta una técnica de montaje para la formación de imágenes el desarrollo del pez cebra D. rerio. Esta técnica consiste en embriones de montaje de tal manera que las regiones de la cabeza y el saco vitelino son casi totalmente incluyen en agarosa, dejando la región del cuerpo posterior para alargar y desarrollarse normalmente. Como tal, también es un método apropiado para la formación de imágenes a largo plazo de otras regiones del cuerpo en desarrollo como la agarosa permite obtener imágenes mediante técnicas de imagen la luz estándar. Este protocolo demuestra montaje de los embriones en una orientación lateral, aunque también es posible montar los embriones en orientaciones alterativas. Se mostrará aún más cómo adaptar el método para configuraciones de microscopía de luz hojas verticales, invertidos y verticales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta técnica de montaje permite que los embriones que se le mantenga aún durante la transferencia al microscopio y más de los experimentos de imagen de lapso de tiempo a largo plazo destinados a la elongación posterior del cuerpo después en múltiples escalas de longitud. Además, es versátil en que permite la formación de imágenes en ambos microscopía en posición vertical e invertida montajes, y una sugerencia se hace para cómo esto puede ser adaptado además para SPIM orientado verticalmente.
<p class="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Téléthon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.
Materials
| CONSUMABLES | |||
| Glass-bottomed dishes | Mattek | P35-1.5-10-C | 35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work. |
| Micro-scalpel | Feather | P-715 | Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| REAGENTS | |||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low-melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| EQUIPMENT | |||
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Binocular dissecting microscope | Leica | S8 Apo |
References
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- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
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