Eine vielseitige Montagemethode für Langzeit Imaging von Zebrabärblingentwicklung
Summary
Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.
Abstract
Zebrabärbling-Embryonen bieten eine ideale experimentelle System komplexe morphogenetischen Prozesse zu untersuchen aufgrund ihrer leichten Zugänglichkeit und optische Transparenz. Insbesondere ist hintere Körperdehnung ein wesentlicher Prozess in der embryonalen Entwicklung, durch die Verformungen mehrere Gewebe zusammen, um die Bildung eines großen Teils der Körperachse zu lenken handeln. Um diesen Prozess durch langfristige Zeitraffer-Bildgebung zu beobachten, ist es notwendig, eine Montagetechnik zu verwenden, die ausreichende Unterstützung ermöglicht es, Proben in der richtigen Ausrichtung während der Übertragung an das Mikroskop und den Erwerb zu halten. Darüber hinaus muss die Montage bieten auch ausreichende Bewegungsfreiheit für das Auswachsen des hinteren Körperbereich ohne seine normale Entwicklung zu beeinflussen. Schließlich muss ein gewisses Maß an Vielseitigkeit des Montage Methode, um Bildgebung auf verschiedenen Abbildungsaufbauten ermöglichen. Hier präsentieren wir eine Montagetechnik für die Abbildung der Entwicklung des hinteren Körpers Elongation in der Zebrabärbling D. rerio. Diese Technik beinhaltet Embryonen, so dass der Kopf und Dottersack Regionen sind fast vollständig in Agarose enthalten, während das Weglassen der hinteren Körperbereich zu verlängern und zu entwickeln, die normalerweise Montage. Wir werden zeigen , wie sich dies für aufrecht, umgekehrt und vertikale Lichtbogen – Mikroskopie – Set-ups angepasst werden. Während dieses Protokoll Embryonen für die Bildgebung bei der Montage für den hinteren Körper konzentriert, könnte es leicht für die Live-Bildgebung von mehreren Aspekten der Zebrabärblingentwicklung angepasst werden.
Introduction
Posterioren Körper Dehnung ist ein wesentlicher Prozess bei der Embryonalentwicklung, durch die der Embryo ein großer Teil der Körperachse zu bilden, erstreckt. Es ist ein Beispiel eines komplexen morphogenetic Prozess, bei dem mehrere Zellverhalten koordinativ die Morphogenese auf der Ebene der einzelnen Gewebe zu erzeugen, wirken. Diese unterschiedlichen Gewebedeformationen dann zusammen wirken, um die Dehnung des hinteren Körpers an der gesamten Strukturebene zu erzeugen. Um zu verstehen , wie diese Prozesse werden gesteuert , und während der Entwicklung koordiniert, müssen wir in der Lage sein , diese Verfahren bei mehreren Skalen zu folgen (dh auf der Ebene von Molekülen, Zellen, Zellpopulationen und Gewebe) , und dieses an die Morphogenese der gesamten Struktur direkt zu beziehen .
Zebrabärbling-Embryonen sind für die Bildgebung hintere Körperdehnung ideal als ihre optische Transparenz und die geringe Größe ermöglicht die Anwendung der minimal-invasiven Bildgebung Licht nähert sich gut für Live-Bildgebung. 1 Dieses wurde durch eine Reihe neuerer Publikationen belegt worden , die Licht auf hintere Körperentwicklung auf der Ebene von Molekülen vergossen haben, 2 Einzelzellen, 3 und inter Gewebe Verhaltensweisen, 4 sowie auf der Ebene der Zellpopulation und ganze Organ. 5
Advanced Imaging-Techniken wie konfokale Multiphotonenmikroskopie und selektive Ebene Beleuchtung Mikroskopie (SPIM) ermöglichen die langfristige Darstellung von Entwicklungsprozessen mit einer verminderten Wirkung von Licht Toxizität und Photobleaching. Robusten Techniken für die Montage von lebenden Proben benötigt werden drei Ziele zu erreichen: 1) eine ausreichende Unterstützung für das Mikroskop während der Übertragung Proben in der richtigen Ausrichtung zu halten und während der Aufnahme, 2) eine ausreichende Bewegungsfreiheit der Probe für das Auswachsen zu ermöglichen von der hintere Körperbereich ohne seine normale Entwick beeinflussenwicklung und schließlich 3) ein gewisses Maß an Vielseitigkeit des Montageverfahrens Bildgebung auf verschiedenen Imaging-Setups zu ermöglichen.
Dieses Protokoll stellt eine Montagetechnik zum Abbilden der Entwicklung der Zebrabärbling D. rerio. Diese Technik beinhaltet Embryonen so dass der Kopf und yolk sac Regionen fast vollständig in Agarose enthalten, während Verlassen der posterior Körperbereich zu verlängern und zu entwickeln, die normalerweise Montage. Als solches ist es auch ein geeignetes Verfahren für die Langzeit-Bildgebung von anderen Regionen des Entwicklungs Körper als die Agarose Bildgebung durch Standardlichtabbildungstechniken ermöglicht. Dieses Protokoll veranschaulicht in einer seitlichen Ausrichtung von Embryonen Befestigungs, obwohl es auch möglich ist, Embryonen in alternativen Orientierungen zu montieren. Es wird weiter zeigen, wie das Verfahren zur aufrechten, umgedreht und vertikale Lichtbogen-Mikroskopie-Setups anzupassen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Befestigungstechnik ermöglicht Embryonen noch während der Übertragung an das Mikroskop und über an folgenden hinteren Körperdehnung mehrere Längenskalen dem Ziel eines langfristigen Zeitraffer-Imaging Experimente gehalten werden. Darüber hinaus ist es vielseitig, dass sie für die Bildgebung auf beiden aufrechten und der inversen Mikroskopie Aufbauten erlaubt, und ein Vorschlag gemacht wird, wie dies weiter vertikal ausgerichtet SPIM angepasst werden.
Ein entscheidender Schritt …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Téléthon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.
Materials
| CONSUMABLES | |||
| Glass-bottomed dishes | Mattek | P35-1.5-10-C | 35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work. |
| Micro-scalpel | Feather | P-715 | Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| REAGENTS | |||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low-melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| EQUIPMENT | |||
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Binocular dissecting microscope | Leica | S8 Apo |
References
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- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
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