Une méthode de montage polyvalent pour l'imagerie à long terme du développement Zebrafish
Summary
Here, we present a versatile mounting method that allows for the long-term time-lapse imaging of the posterior body development of live zebrafish embryos without perturbing normal development.
Abstract
embryons de poisson zèbre offrent un système expérimental idéal pour étudier les processus morphogénétiques complexes en raison de leur facilité d'accès et de transparence optique. En particulier, l'allongement du corps postérieur est un processus essentiel dans le développement embryonnaire par lequel de multiples déformations des tissus agissent ensemble pour diriger la formation d'une grande partie de l'axe du corps. Afin d'observer ce processus en imagerie time-lapse à long terme, il est nécessaire d'utiliser une technique de montage qui permet un soutien suffisant pour maintenir les échantillons dans l'orientation correcte pendant le transfert au microscope et acquisition. En outre, le montage doit également assurer la liberté de mouvement suffisante pour l'excroissance de la région postérieure du corps sans affecter son développement normal. Enfin, il doit y avoir un certain degré de polyvalence de la méthode de montage pour permettre l'imagerie sur diverses imagerie set-ups. Ici, nous présentons une technique de montage pour l'imagerie du développement du corps postérieur elongation dans le zebrafish D. rerio. Cette technique implique des embryons de telle sorte que les régions tête et jaune sac sont presque entièrement inclus dans agarose de montage, tout en laissant la région postérieure du corps pour allonger et se développer normalement. Nous allons montrer comment cela peut être adapté à la verticale, inversé et vertical microscopie optique-feuille set-ups. Bien que ce protocole met l'accent sur les embryons pour l'imagerie du corps postérieur de montage, il pourrait facilement être adapté pour l'imagerie en direct de plusieurs aspects du développement du poisson zèbre.
Introduction
Postérieur corps d'allongement est un processus essentiel dans le développement embryonnaire de l'embryon qui se prolonge pour former une partie importante de l'axe du corps. Il est un exemple d'un processus complexe par lequel morphogénétique comportements cellulaires multiples agissent de façon coordonnée pour générer la morphogenèse au niveau des tissus individuels. Ces déformations du tissu différentiel agissent alors ensemble pour produire l'allongement du corps postérieur au niveau de l'ensemble de la structure. Pour comprendre comment ces processus sont contrôlés et coordonnés au cours du développement, nous devons être en mesure de suivre ces processus à des échelles multiples (ie au niveau des molécules, des cellules, des populations de cellules et de tissus) et de relier cela directement à la morphogenèse de l' ensemble de la structure .
embryons de poisson zèbre sont idéales pour le corps imagerie postérieure allongement de leur transparence optique et de petite taille permet à l'application de l'imagerie de la lumière mini-invasive des approches bien adaptées à live imagerie. 1 Ceci a été mis en évidence par une série de publications récentes qui ont mis en lumière le développement du corps postérieur au niveau des molécules, 2 cellules simples, 3 et inter-tissulaires comportements, 4 ainsi qu'au niveau de la population cellulaire et un organe entier. 5
Les techniques d'imagerie avancées telles que confocale, la microscopie multi-photonique et la microscopie d'éclairage plan sélectif (SPIM) permettent à l'imagerie à long terme des processus de développement avec une diminution de l'effet de la toxicité lumière et photo-blanchiment. techniques robustes pour le montage d'échantillons vivants sont nécessaires pour atteindre trois objectifs: 1) un soutien suffisant pour maintenir les échantillons dans l'orientation correcte pendant le transfert au microscope et lors de l'acquisition, 2) la liberté de mouvement suffisante de l'échantillon pour permettre l'excroissance de la région postérieure du corps sans affecter son devel normaleloppement, et enfin 3) un certain degré de polyvalence de la méthode de montage pour permettre l'imagerie sur diverses imagerie set-ups.
Ce protocole a introduit une technique de montage pour imager le développement du poisson zèbre D. rerio. Cette technique implique des embryons de montage de telle sorte que les régions de la tête et le sac vitellin sont presque entièrement inclus dans l'agarose, tout en laissant la région postérieure du corps pour allonger et se développer normalement. En tant que tel, il est également une méthode appropriée pour l'imagerie à long terme d'autres régions du corps en développement l'agarose permet l'imagerie par des techniques d'imagerie de lumière standard. Ce protocole démontre montage des embryons dans une orientation latérale, mais il est également possible de monter des embryons dans des orientations altératives. Il va encore montrer comment adapter la méthode pour vertical, inversé et verticales configurations de microscopie optique à feuille.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette technique de montage permet embryons à conserver encore pendant le transfert au microscope et plus des expériences d'imagerie time-lapse à long terme visant à la suite postérieure allongement du corps à des échelles de longueur multiples. En outre, il est souple en ce qu'elle permet d'imagerie sur la microscopie en position verticale et inversée set-up, et une suggestion est faite pour savoir comment cela peut être adapté en outre pour SPIM orienté verticalement.
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Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estelle Hirsinger: Core funding from the Institut Pasteur and Agence Nationale de la Recherche (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS). Estelle Hirsinger is from the Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS). Benjamin Steventon was funded by the Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), then a Roux fellowship (Institut Pasteur) then an AFM-Téléthon fellowship (number 16829). He is now supported by a Wellcome Trust/Royal Society Sir Henry Dale Fellowship.
Materials
| CONSUMABLES | |||
| Glass-bottomed dishes | Mattek | P35-1.5-10-C | 35mm petri dish, 10mm microwell. No. 1.5 cover glass |
| Capillaries for injection needles | Sutter | BF 120-94-10 | We use orosilicate glass with filament, OD 1.20 mm, ID 0.94 mm, length 10 cm. However, filament needles are not necessary and most injection standard needles should work. |
| Micro-scalpel | Feather | P-715 | Micro Feather disposable opthalmic scalpel with plastic handle |
| Pasteur Pipettes | 230 mm long | ||
| REAGENTS | |||
| Tricaine | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Low-melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| EQUIPMENT | |||
| Fine forceps | FINE SCIENCE TOOLS GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
| Needle puller | Sutter | P97 | Heating-filament needle puller |
| Binocular dissecting microscope | Leica | S8 Apo |
References
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- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmentation Clock Dynamics. Dev Cell. 23 (5), 995-1005 (2012).
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