「Acufection」と肌の研究への応用により、経済的なDNAデリバリーシステムの開発
Summary
このプロトコルは、マウスの皮膚に裸のプラスミドDNAを発現するための費用対効果の高い代替法です。プロトコルの全体的な目標は、皮膚の炎症における特定の遺伝子の機能的役割を描写するために皮膚組織への免疫関連遺伝子を提供することです。
Abstract
皮膚の免疫応答の調節不全は、多くの人間の皮膚疾患と関連しています。皮膚組織への免疫関連遺伝子の直接転写は、ヒト疾患のマウスモデルにおける皮膚炎症の免疫調節を調査するための魅力的なアプローチです。ここでは、マウスの皮膚に裸のDNAを提供し、導入遺伝子の発現をもたらすコスト効率のプロトコルを提示します。この方法は、ACUパンク媒介DNAトランスフェクションを示す、「acufection」を造語しています。 acufectionを実行するために、マウスの皮膚は、最初のリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中にDNAを注入した後、細胞にDNAおよびトランスフェクションの吸収を容易にするために、鍼治療針の束で軽く刺しました。プラスミドDNAは、おそらく、ケラチノサイト及び皮膚での樹状細胞（DC）によって取り込まれ、タンパク質に発現されます。針自体に機械的にプリックは、皮膚の損傷を引き起こしたり、ケラチノサイトの活性化を誘導しませんでした。表現トランスフェクトされた遺伝子の2日間acufection次転写および翻訳の両方のレベルで皮膚中で検出されたと7日まで維持。このacufection法の開発のための第一の目標は、IL-15の以前に未定義のアイソフォームを調査することでした。炎症を誘導するために、皮膚中で発現させ、続いてToll様受容体7（TLR7）アゴニスト、イミキモド（IMQ）で処理し、この方法は、部分的に欠失し、エクソン7（IL-15ΔE7）と選択的にスプライシングされたIL-15アイソフォームを用いました。皮膚におけるAcufection送達IL-15ΔE7はIMQ誘発性皮膚炎症においてケラチノサイト増殖、表皮の厚さと好中球動員を抑制しました。皮膚炎症の調節機構を同定することに関心の高まりとともに、ここで説明するプロトコルは、 インビボにおける DNA送達のための遺伝子銃システム又はmicroseedingに費用効果的かつ多目的な代替物を提供します。これは、潜在的に小説の機能の発見を可能にすることができます皮膚内または皮膚疾患の新しい治療法を調査するための遺伝子。
Introduction
皮膚は、宿主防御の第一線です。ケラチノサイト（KCS）は、ヒトとマウスの皮膚における主要な細胞型です。環境刺激（ 例えば、日光、酸素、化学物質や病原性浸潤）に応答して、KCSは、活性化され、このようなIL-8、IL-6、IL-1α、IL-1β、TNF-αなどの炎症性サイトカインおよびケモカインの広い配列を生成していますαおよびGM-CSF 1。彼らは一緒に皮膚への免疫細胞の動員を誘発します。悪化皮膚炎症は、多くの場合、急性異所性接触性皮膚炎および慢性のT細胞媒介性炎症（ 例えば、アレルギー性接触性皮膚炎および乾癬）2を含む多数のヒト疾患に関連付けられています。 KC活性化を阻害することにより、皮膚の炎症誘発性の応答を調節することは、皮膚の炎症を治療するためのもっともらしいアプローチです。このプロトコルは、一過性免疫解像度を研究するために、表皮におけるサイトカイン遺伝子を発現するための新しいアプローチを説明します皮膚のような治療に必然ponse。
表皮は、皮膚の最表層を構成します。それは、皮膚のより深い層に侵入するような核酸および病原体などの外部物質を保持物理的障壁として働きます。いくつかの無針技術は、表皮のDNAの転送3、4のために確立されています。溶液中のDNAまたはカチオン性リポソームまたはアデノウイルスベクターに関連した直接そのような角質層の除去または試薬を脱毛での処理のような技術を用いて修飾された表皮に適用されています。角化上皮の除去は、DNAケラチノサイトおよび免疫応答5を誘発するランゲルハンス細胞と表皮バリアとの相互作用を横断を容易にします。大きな表面積は、DNAの転送のために利用可能であり、このアプローチは、針を必要としませんが、要件を含む欠点があります（ – 100μgの10）、ストリッピングによって皮膚に過酷な治療、及びDNA送達ブースター6なしで免疫された動物において免疫応答を誘導するのに矛盾した結果、DNAの大量のために。皮膚への裸のDNAの微粒子媒介性の細胞内送達は、免疫応答7,8を誘導するための非常に効率的で再現性のあることが示されています。手持ち遺伝子銃は、加圧されたヘリウム空気流9により径2μm直径プラスミドDNA被覆金粒子による皮膚の標的部位に衝突するために使用されています。プラスミドDNAは、おそらく皮膚にKCsand樹状細胞（DC）によって取り込まれ、タンパク質が局所的に発現されるか、またはDCを10によって流入領域リンパ節に輸送されます。遺伝子銃システムはシンプルで、限られた技術的な経験を必要とし、「DNA BULを準備し、提供するためのコストが、う」（ すなわち、金粉末、ヘリウムガス）および遺伝子銃用自体は、その一般的な適用を制限している。実験は異なる場所で行われる場合に加えて、ヘリウムガス供給システムの要件は、遺伝子銃の輸送の容易さを制限する。Microseeding単回注射、粒子ボンバードメント11よりも遺伝子導入の高い効率を達成することが実証されている。Microseedingは粒子ビーズ11を使用せずに皮膚にDNAを送達するために入れ墨銃を使用する。このアプローチを用いて皮膚上にマイクロニードルを発振する可能性があります直接細胞膜をこすり、したがって、同時に複数の細胞にDNAを移す。ただし、0.254ミリメートル直径の針を注射の多数に関連する疼痛が欠点です。
ここでは、in vivoでの DNA送達するための別のアプローチを提供します。 「acufection」 </strオング>私たちはここで説明するプロトコルは、マウスの皮膚にプラスミドDNAを提供する経済的かつ効率的な方法を提供します。簡潔には、10本の鍼治療針（長さX 13ミリメートル、直径0.2 mm）を粘着テープによってバンドルに結合させました。目的の導入遺伝子を含むプラスミドDNAの10μgのPBS中の10μLの体積を剃毛、脱毛クリームで処理した脇腹皮膚上に置きました。皮膚の表面（1センチメートル×1 cm）を発振する鍼バンドルを使用して、角質層におけるケラチンを緩めし、表面に適用されるプラスミドDNAは、表皮に吸収させました。皮膚の損傷を監視し、最小限であることが判明しました。 acufected皮膚におけるトランスフェクトされた遺伝子の発現を、定量的リアルタイムPCR（定量RT-PCR）およびELISAの両方で確認しました。皮膚炎症に対するacufection送達IL-15ΔE7の免疫調節効果は、IMQ処理されたマウスモデル12を使用して実証されました。 acufectionは簡単で、あまりDEMAであると証明する一方でインビボにおける DNA送達のための方法をnding、異なる遺伝子及び皮膚を刺すための時間のDNAの最適量は注意深く再現性のある結果を得るために最適化されなければなりません。
Protocol
Representative Results
Discussion
acufectedプラスミドDNAの発現を確実にするために最も重要なステップは、均等に振動し、皮膚の角質層を緩めることです。皮膚を切断することなく穏やかに針を押しながら、力は、表面を押圧しにくい十分であるべきです。 1センチメートルX 1cmの面積に10μL溶液中のDNAの吸収を促進するために、針は30秒で約100回上下に振動するべきです。一つは、肌を刺すとacufected遺伝子の最高発現レベルを?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、科学技術省からの助成金によってサポートされていました（MOST 103から2633-B-002から002; 104から2320-B-002から048）。私たちは、博士に感謝します。原稿を読み取るためのベティ呉謝とハワイ大学のスタンフォード大学博士とピーター・ホフマンのNTUでチェンクオ・リー、リー・ゼボーニ、農業バイオテクノロジーの技術支援のためのNTUでユンチェン、博士ウェン・チ・ウェイ技術的助言のための中央研究院の研究センター。
Materials
| Accu Handy Needle | Accu | 36Gx0.5 | Medical device |
| NairTM Lotion | Church & Dwight | N/A | Use to remove hair |
| Shandon Xyline substitute | Thermo Fisher Scientific | 6764506 | Deparaffinization |
| Avertin (2,2,2-Tribromethanol) | Sigma-Aldrich | T4,840-2 | Anesthesia |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | Solvent for the dissolution of avertin |
| DifcoTM LB broth, Miller | BD | 244620 | Propagation and maintenance of E. coli for molecular biology |
| QIAGENⓇ Plasmid Midi Kit | QIAGEN | 12143 | Purification of plasmid DNA from E. coli |
| Mouse IL-15/IL-15R Complex ELISA Ready-SET-Go kit | eBioscience | 88-7215 | Measure IL-15 protein |
| Anti-mouse Ly6G | BioLegend | 127601 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| anti-mouse Ki-67 | eBioscience | 14-5698-80 | Antibody used for immunohistochemical stain |
| Simple Stain Mouse MAXPO (Rat) | Nichirei Biosciences | 414341F | Reagent to block background signal in mouse-on-mouse stain |
| DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | Peroxidse substrate for immunohistochemical stain |
| Ultra V block | Thermo Fisher Scientific | TA-060-UB | Reduce nonspecific background staining |
| Methyl green | Sigma-Aldrich | M8884 | Nuclear staining |
| Vecta MountTM | Vector Laboratories | M-5000 | Permanently preserving histochemical stains |
| Protease inhibitor cocktail tablets | Roche | 04-693-116-001 | Inhibit protease activity in cell lysate |
| Aldara cream | 3M Parmaceuticals | N/A | 5% imiquimod cream |
| Bessman Tissue Pulverizer | Spectrum Labs | 189475 | Use to pulverize skin tissue |
| ABI7900HT cycler | Thermo Fisher Scientific | N/A | quantitative real-time PCR assay |
| Camcorder | Panasonic | HDC-SD60 | Image documentation |
| Axio Scope.A1 | ZEISS | N/A | Bright-field microscopy |
| ScanScopeⓇ XT | Aperio | N/A | Whole-field image scanner |
| MetaMorphⓇ Research Imaging | Molecular Devices | N/A | Quantitative analysis of skin thickness and immune-reactive cells |
References
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