Флуоресцентным на основе анализа Лимфоцит Подходит для высокопроизводительного скрининга малых молекул

Высокая пропускная способность скрининга (HTS) является проверенным стратегия широко применяется для идентификации новых терапевтических молекул или репозиционирования FDA утвержденных препаратов в новых медицинских показаний. ¹ До сих пор достигнутый успех HTS может быть измерена множеством ранее обнаруженных наркотиков. Например, ингибитор тирозинкиназы лапатиниба, используемый для лечения рака молочной железы, ситаглиптином; дипептидилпептидазы-4 (ДПП-4) ингибитор используют в качестве анти-гипергликемии препарата, и пероральный BCR-ABL ингибитор тирозинкиназы дазатиниб используется для лечения хронического миелолейкоза представляют несколько примеров из длинного перечня утвержденных препаратов, первоначально обнаруженных HTS. ² Хотя производительность фармацевтической промышленности в последнее время страдает от недостатка в открытии новых химических объектов, вероятность успешного открытия новых лекарств может быть повышена за счет увеличения числа доклинических кандидаTES отображающие модуляторные биологические / биохимические свойства. Соответственно, разработка новых HTS анализов, адаптированных для фенотипического скрининга могли бы предложить потенциал, чтобы обеспечить важные фармакологические средства для открытия новых хитов наркотиков. ^{3, 4, 5, 6} Кроме того, HTS теперь могут быть выполнены в более быстром темпе из – за значительных технологических преобразований в последние годы в том числе специально разработанных гибких роботизированных установок, новых технологий Считывание и обширной миниатюризации. ^{2, 7} Среди факторов , способствующих растущий интерес к использованию фенотипического скрининга (он же вперед ФАРМАКОЛОГИЯ) является восприятие , что акцент на функциональных эффектов , а не упрощенными редукционистских предположений относительно молекулярных мишеней (целевых на основе скрининга / биохимических реакций), скорее всего , шо ш клиническая эффективность. Таким образом, фенотипический скрининг держит обещание раскрыть новые потенциально терапевтических соединений и молекулярных механизмов в настоящее время неизлечимых заболеваний. ²

Для правильной идентификации ингибиторов или активаторов для данной молекулярной мишени или клеточной функции, высокочувствительным и надежным анализ необходим для того , чтобы различать добросовестных хитов FIDE и ложных срабатываний. Итак, что делает хороший анализ? Качество данного анализа должны быть сначала судить по соотношению сигнал-шум (отраженный через Z фактор). ⁸ Во- вторых, целенаправленный эффект или цель экрана должны быть четко определены. Например, функциональные клеточные подходы могут предложить значительные преимущества для скрининга рецепторов, в отличие от анализа, специально предназначенные для оценки связывания лиганд-рецептор. Причина этого заключается в том, что последний подход не может дифференцировать между агонистов и антагонистов лигандов.сс = "Xref"> 9 В отличие от этого , подход на основе клеток, вероятно, будет более эффективным , как функция рецептора может быть непосредственно оценена в биологическом фенотипу (пролиферации, клеточного цикла, апоптоза, и / или дифференцировки). Тем не менее, следует отметить, что биохимические анализы могут обеспечить значительные преимущества по сравнению с фенотипическими анализами, поскольку они нарушают на специфические внутриклеточные мишени. Хорошо оптимизированная биохимический анализ, как правило, имеют меньший разброс данных, чем фенотипического скрининга при одновременном упрощении после исследований, связанных с наркотиками молекулярного механизма действия. Тем не менее, основным недостатком целевых показателей на основе или биохимических анализов является возможность усиливать уровень ложных положительных хитов, которые могут повлиять на неспецифические цели при испытании в биологической системе (потеря специфичности, первоначально изученной в биохимическом анализе). ¹⁰ Несмотря на то, хорошо налаженные точка отсечки между отрицательными и положительными хитов можно свести к минимуму число ложных срабатываний яп первичного скрининга, использование физиологически соответствующей системы, имитирующей нативную клеточную среду, таких как интактные клетки, цельной ткани или целого животного остается основой дизайна анализа маятника. Поэтому фенотипический скрининг позволяет открытие свинца с желаемыми биологическими / фенотипических эффектов для заболеваний без каких-либо идентифицированных мишеней для лекарственных средств без предварительного знания о деятельности соединения или способа действия. ¹¹

Исследование здесь, относится к разработке и тестированию оптимизированной и воспроизводимым скрининга фенотипической на основе двух важных компонентов: коммерчески доступной модели мыши и кластерном подсемейство химических соединений. Что касается животной модели, анализ основан на использовании лимфоцитов , полученных из штамма мыши (Nur77 ^GFP) укрывает бактериальную искусственную хромосому , содержащую кассету , в которой экспрессия зеленого флуоресцентного белка (GFP) приводится в движение гое Nur77 промотор. ¹² Отличительной чертой данной стимуляции основана на том факте , что Nur77 является непосредственным раннего гена повышающей регуляции следующие Т-клеточного рецептора (TCR) или рецептора В-клеток (BCR) стимуляции. ¹² Что касается самого метода скрининга, подход был использован , чтобы помочь избежать скрининга тривиальных аналогов при одновременной минимизации времени , необходимого для оценки большой химической библиотеки (> 10 ⁵ соединений). Для этого, база данных химических соединений, выбранных лекарственных химиками с использованием виртуальных инструментов скрининга была использована для выявления топологически подобных соединений, используя известные активные семенные структуры как ссылки. Такой подход позволил нам экран 4398 соединений, представляющих общую библиотеку из более чем 136000 химических объектов.