Una fluorescenza a base di linfociti Assay Adatto per high-throughput screening di piccole molecole

screening ad alto rendimento (HTS) è una strategia collaudata ampiamente adottata per l'identificazione di nuove molecole terapeutiche o per il riposizionamento dei farmaci approvati dalla FDA a nuove indicazioni mediche. ¹ Finora, il successo ottenuto HTS può essere misurata dalla pletora di farmaci precedentemente scoperto. Per esempio, l'inibitore lapatinib tirosina chinasi utilizzato per il trattamento del cancro al seno, sitagliptin; un inibitore della dipeptidil peptidasi-4 (DPP-4) inibitore utilizzato come un farmaco anti-iperglicemici, e la Bcr-Abl dasatinib inibitore della tirosin-chinasi orale, usati per il trattamento della leucemia mieloide cronica rappresentano alcuni esempi di una lunga lista di farmaci approvati originariamente scoperti da HTS. ² Sebbene la produttività dell'industria farmaceutica ha recentemente sofferto di una mancanza nella scoperta di nuove entità chimiche, la probabilità di scoperta di farmaci successo può essere migliorata attraverso un aumento del numero di candida pre-clinicates visualizzazione modulatori proprietà biologiche / biochimiche. Di conseguenza, lo sviluppo di nuovi test HTS adatti per lo screening fenotipico potrebbe offrire il potenziale per fornire importanti strumenti farmacologici per la scoperta di nuovi successi di droga. ^{3, 4, 5, 6,} inoltre, HTS possono ora essere eseguiti a un ritmo più veloce a causa di significative trasformazioni tecnologiche degli ultimi anni inclusi gli impianti progettati su misura flessibili robot, tecnologie di read-out nuovi e ampie miniaturizzazione. ^{2, 7} Tra i fattori che contribuiscono al crescente interesse per l'uso dello screening fenotipico (aka avanti farmacologia) è la percezione che concentrarsi sugli effetti funzionali, piuttosto che ipotesi riduzioniste semplificate in materia di bersagli molecolari (di screening / reazioni biochimiche di obiettivi) è più probabile per sho w efficacia clinica. Così, lo screening fenotipico mantiene la promessa per scoprire nuovi composti potenzialmente terapeutici e meccanismi molecolari di malattie attualmente incurabili. ²

Per identificare correttamente inibitori o attivatori di un determinato bersaglio molecolare o la funzione cellulare, un saggio altamente sensibile e affidabile è necessario al fine di differenziare tra i colpi in buona fede e falsi positivi. Quindi, ciò che rende un buon test? La qualità di un determinato dosaggio deve essere dapprima giudicato dal rapporto segnale-rumore (riflessa attraverso un fattore Z). ⁸ In secondo luogo, l'effetto mirato o l'obiettivo dello schermo devono essere chiaramente stabiliti. Ad esempio, gli approcci basati su cellule funzionali in grado di offrire vantaggi significativi per lo screening dei recettori in contrapposizione a un test specificamente progettato per valutare ligando-recettore vincolante. La ragione di questo è che quest'ultimo approccio non può distinguere tra agonisti e antagonisti ligandi.ss = "xref"> 9 Al contrario, un approccio a base di cellule è probabilmente più efficace in funzione del recettore può essere valutata direttamente in un fenotipo biologica (proliferazione, arresto del ciclo cellulare, apoptosi, e / o differenziazione). Tuttavia, si deve notare che saggi biochimici possono fornire vantaggi significativi rispetto saggi fenotipici poiché violano su uno specifico bersaglio intracellulare. Un test biochimico ben ottimizzato in genere hanno meno dispersione dei dati di uno screening fenotipico, semplificando dopo indagini connesse con il meccanismo molecolare della droga di azione. Tuttavia, il grave inconveniente di saggi di obiettivi o biochimica è la possibilità di amplificare il tasso di risultati falsi positivi che possono influenzare obiettivi non specifici quando testato in un sistema biologico (perdita della specificità originariamente studiato nel saggio biochimico). ¹⁰ Anche se un punto di cut-off ormai consolidata tra i colpi negativi e positivi può ridurre al minimo il numero di falsi positivi in screening preliminare, l'uso di un sistema fisiologicamente rilevanti mimando l'ambiente cellulare nativo come le cellule intatte, tessuti interi o intero animale rimane il nucleo del pendolo disegno dosaggio. Pertanto, lo screening fenotipico consente scoperta vantaggio con effetti fenotipici biologici / desiderabili per le malattie senza bersagli farmacologici identificati senza avere una conoscenza preventiva di attività o modalità di azione del composto. ¹¹

Lo studio qui riguarda lo sviluppo e la sperimentazione di uno screening fenotipico ottimizzato e riproducibili sulla base di due componenti importanti: un modello di topo disponibile in commercio e un cluster sotto-famiglia di composti chimici. Rispetto al modello animale, il saggio si basa sull'impiego di linfociti derivati da un ceppo di topi (Nur77 ^GFP) ospitare un cromosoma artificiale batterico contenente una cassetta in cui l'espressione della proteina fluorescente verde (GFP) è azionato da the Nur77 promotore. ¹² La caratteristica di questa stimolazione è basata sul fatto che Nur77 è immediatamente gene precoce up-regolata seguente recettore delle cellule T (TCR) o stimolazione del recettore delle cellule B (BCR). ¹² Per quanto riguarda il metodo di screening per sé, un approccio è stato utilizzato per contribuire ad evitare la proiezione di analoghi banali riducendo al minimo il tempo necessario per valutare una grande libreria chimica (> 10 ⁵ composti). Per fare ciò, una banca dati di composti chimici selezionati dai chimici medicinali che utilizzano strumenti di screening virtuali è stata sfruttata per identificare i composti topologicamente simili utilizzando note strutture di semi attivi come riferimenti. Questo approccio ci ha permesso di selezioniamo 4.398 composti che rappresentano una libreria complessiva di oltre 136.000 entità chimiche.