Summary

준비 및 평가<sup> 99m</sup> Bioorthogonal 화학을 사용하여 사전이 타겟팅에 대한 세자리 킬레이트를 Tc를 표지

Published: February 04, 2017
doi:

Summary

Here, we describe a protocol for radiolabeling and in vivo testing of tridentate 99mTc(I) chelate-tetrazine derivatives for pre-targeting and bioorthogonal chemistry.

Abstract

Pre-targeting combined with bioorthogonal chemistry is emerging as an effective way to create new radiopharmaceuticals. Of the methods available, the inverse electron demand Diels-Alder (IEDDA) cycloaddition between a radiolabeled tetrazines and trans-cyclooctene (TCO) linked to a biomolecule has proven to be a highly effective bioorthogonal approach to imaging specific biological targets. Despite the fact that technetium-99m remains the most widely used isotope in diagnostic nuclear medicine, there is a scarcity of methods for preparing 99mTc-labeled tetrazines. Herein we report the preparation of a family of tridentate-chelate-tetrazine derivatives and their Tc(I) complexes. These hitherto unknown compounds were radiolabeled with 99mTc using a microwave-assisted method in 31% to 83% radiochemical yield. The products are stable in saline and PBS and react rapidly with TCO derivatives in vitro. Their in vivo pre-targeting abilities were demonstrated using a TCO-bisphosphonate (TCO-BP) derivative that localizes to regions of active bone metabolism or injury. In murine studies, the 99mTc-tetrazines showed high activity concentrations in knees and shoulder joints, which was not observed when experiments were performed in the absence of TCO-BP. The overall uptake in non-target organs and pharmacokinetics varied greatly depending on the nature of the linker and polarity of the chelate.

Introduction

99m Tc를 전 세계적으로 올해 1, 2, 3 당 실시 만 50 이미징 절차에 진단 핵 의학에서 사용되는 지배적 인 방사성 동위 원소, 남아있다. 임상 적으로 사용되는 99m Tc를 제의 대부분은 관류 형 방사성 의약품이다. 99m Tc를가 표적화 구조물에 라이 게이션을 통해 특정 바이오 마커에 결합하도록 지시하는 능동적 표적 화합물의 제한된 수있다. 타겟 99m Tc를 방사성 의약품의 생성은 종종 관심의 바이오 마커에 결합하는 표적 분자의 능력 99m Tc를 리간드 복합체의 영향에 의해 방해하거나 동위 원소 반감기 고 분자량 생체 분자와 함께 사용하도록 충분히 길게하지 않다 이러한 항체. 이미지가 담배 마는 비 대상에서 삭제하는 생체 분자의 순서를 인수하기 전에 후자는 일반적으로 몇 일이 필요합니다 단말. 사전 타겟팅은 이러한 문제를 극복하기위한 대안적인 접근 방식을 제공합니다.

bioorthogonal 화학 결합 사전 타겟팅 모두 형광 무선 촬상 4, 5, 6, 7, 8에 대한 새로운 분자 이미징 프로브를 개발하는 효과적인 방법으로 밝혀졌다. 도 1에 도시 된 바와 같이, 1,2,4,5- 테트라 (Tz 일) 및 트랜스 -cyclooctene (TCO) 유도체의 역 전자 수요 딜스 – 알더 (IEDDA) 반응은 6 특히 효과적인 것으로 밝혀졌다. 이러한 구성 요소와 IEDDA 반응은 높은 선택성, 생체 사전 타겟팅 응용 프로그램 (9), (10)에 이상적 (2 ≈ 6,000 M -1의 -1 k)를 PBS에 빠른 반응 속도를 나타낼 수있다.

e_content "> 사용되는 가장 일반적인 방법은 TCO 파생 대상 벡터를 관리하고 충분한 지연 기간에 따라 포함하는 방사성 표지 테트라 투여한다. 방사성 표지 tetrazines을왔다 11 C, 18 F, 64 구리, 89 ZR, 111 년을 기준으로 13, 12, 11 내지 14, 15를보고 하였다. 반면, 생체 내에서 결합 단백질 및 열화를 방지하기 위해 CO 리간드의 사용을 필요로하는 HYNIC 형 리간드를 사용하여 제조 하였다 Tz 일 Tc를이 – 표식 99m, 단지 하나의 보고서가있다 16. 다른 방법으로, 우리는 + 코어 [3 99m Tc를 (CO)]을 안정 세자리 복합체를 형성 리간드 제품군을 사용하여 tetrazines를 표시 여기 99m Tc를 (I)의 합성을보고합니다.

<p class="jove_content" fo:keep-together.within-p나이 = "1"> 그림 1
그림 1 : 테트라 트랜스 -cyclooctene 사이의 bioorthogonal IEDDA 반응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

준비 리간드의 가족은 극성과 금속 결합 영역과의 Tz (그림 2) 사이의 링커 그룹의 성격에 차이가 세자리 킬레이트를 포함한다. 목표는 고속 목표 대 비 표적 비율을 수득하기 위해, 테크네튬 테트라가 효과적으로 지역화 및 TCO 표지 된 생체 부위와 결합하지 않을 때 빠르게 클리어와 반응 할 수있는 구성 99m을 확인 하였다. 리간드를 테스트하기 위해, 비스포스포네이트의 TCO 파생 (TCO-BP)는 17을 사용 하였다. 우리는 TCO-BP 활성 골대사의 영역에 편재와 반응 할 수 있음을 미리 보여생체 (18)에서 방사성 표지 tetrazines. 이 단일 단계로 제조 될 수 있으며, 실험 지역화 주로 관절 (무릎, 어깨)에 발생하는 정상 마우스에서 수행 될 수 있기 때문에, 새로운 tetrazines 테스트하는 편리한 시약이다.

Protocol

동물 실험은 동물 관리에 캐나다위원회 (CCAC) 지침에 따라 맥 매스터 대학의 동물 연구 윤리위원회의 승인을했다. 99m Tc를 가진 Tz 일 – 세자리 리간드 1. 방사성 표지 주의 : 다음 절차 방사성 화합물의 사용을 요구한다. 작업은 안전 및 폐기 규정을 준수하여 허가 된 실험실에서 수행해야합니다. 전자 레인지 반응은 특히 화학 합성을 위해 설?…

Representative Results

리간드는 시판되는 테트라 22 23 생성물의 결합에 의해 다음 간단한 환원성 아 민화 전략 (도 2)를 통해 다른 링커 및 킬레이트 제를 사용하여 합성 하였다. 방사성 표지는 모든 화합물에 대한 방법과 동일한 방법을 사용하여 수행 재현성이었다. 83 % (1) 45 % (2) 31 % 공정은 테크네튬 방사성 표?…

Discussion

다양한 극성의 테트라 링크 세자리 킬레이트의 컬렉션을 준비하고, 생체 내에서 TCO 유도체와 IEDDA 반응에서 자신의 99m Tc를 단지의 유틸리티를 평가 하였다. 효과적이고 재현 99m Tc를 라벨링 방법은 리간드 농도가 라벨링 단계 (화합물 2-5) T- 부틸 기의 탈 보호 하였다 10-3 M.이었다 다섯 테트라 – 킬레이트 위해 개발되었다. 리간드의 농도는 높은 방…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work supported by research grant funding from the Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) of Canada, the Ontario Institute for Cancer Research (OICR, #P.SI.015.8), and the Canadian Cancer Society (CCS, #703857). The authors acknowledge the contributions of Dr. Denis Snider who provided assistance in preparing the manuscript.

Materials

Argon gas  Alphagaz
Na2CO3 EMD Millipore 106395
Na2B4O7.10H2O Anachemia S9640
KNaC4H4O6.4H2O Anachemia 217255
Technelite 99mTc generator Lantheus medical imaging Source of 99mTcO4-
0.9% Saline Lantheus medical imaging To elute generator
1 M HCl Lab Chem
MeOH Caledon
ACN Caledon HPLC grade
Millipore H2O Thermo Fisher Scientific   Barnstead Nanopure
DCM Caledon
TFA Caledon
PBS Thermo Fisher Scientific 10010023 pH 7.4 1X
BSA Sigma Aldrich A7906
Tween80 Sigma Aldrich P8047
Isoflurane  CDMV 108737 Supplier: Fresenius Kabi Animal Health 
HPLC  Waters  1525 Binary Pump, 2998 Photodiodde Array Detector, E-SAT/IN, Bioscan Flowcount PMT detector (item # 15590)
HPLC column for analysis and purification of compounds 2-4 Phenomenex 00G-4435-E0 Gemini® 5 µm C18 110 Å, LC Column 250 x 4.6 mm,
HPLC column for analysis and purification of compounds 1 and 5 Waters  186003115 XBridge BEH C18 Column, 130 Å, 5 µm, 4.6 mm X 100 mm
Microwave Reactor  Biotage  Initiator 8
Biotage V10 Evaporator Biotage  Serial # V1041
Dose calibrator Capintec, Inc.  CRC-25R
Gamma counter Perkin Elmer Wizard 1470 Automatic Gamma Counter
Animal room scale  Mettler Toledo XP105 Delta Range
Microwave vials  Biotage  355629 0.5-2 mL 

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Bilton, H. A., Ahmad, Z., Janzen, N., Czorny, S., Valliant, J. F. Preparation and Evaluation of 99mTc-labeled Tridentate Chelates for Pre-targeting Using Bioorthogonal Chemistry. J. Vis. Exp. (120), e55188, doi:10.3791/55188 (2017).

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