التكشف وظيفة من المستجيب البكتيرية من مسببات الأمراض النباتية غير الصالحة للزراعة باستخدام الخميرة شاشة ثنائية مختلطة
Summary
البروتينات المستجيب البكتيرية مهمة لتأسيس العدوى الناجحة. يصف هذا البروتوكول تحديد التجريبي للشركاء ملزم البروتينية من بروتين المستجيب البكتيرية في مضيف النباتات الطبيعية لها. أصبح تحديد هذه التفاعلات المستجيب عبر الخميرة الشاشتين الهجين أداة مهمة في كشف استراتيجيات المرضية الجزيئية.
Abstract
التكشف الآليات الجزيئية من مظاهر المرض من المهم أن نفهم الأمراض والتنمية أعراض في علم النبات. وقد تطورت البكتيريا استراتيجيات مختلفة للتلاعب الأيض المضيفة لمصلحتهم الخاصة. وغالبا ما يقترن هذا التلاعب البكتيرية مع تطور أعراض شديدة أو وفاة النباتات المتضررة. أصبح تحديد جزيئات بكتيرية محددة مسؤولة عن التلاعب المضيف مجال هام في الأبحاث الميكروبيولوجية. بعد تحديد هذه الجزيئات البكتيرية، ودعا "المؤثرات"، فمن المهم توضيح وظيفتها. نهج واضحة لتحديد وظيفة من المستجيب في تحديد شريك ملزم البروتينية في المضيف الطبيعي عبر شاشة الخميرة اثنين الهجين (Y2H). عادة المضيف المرافئ عدد كبير من الشركاء المحتملين ملزم التي لا يمكن التنبؤ بما فيه الكفاية من قبل أي في خوارزمية SILICO. وبالتالي، فإن أفضل خيار لPERFORM شاشة مع المستجيب افتراضية ضد مكتبة كاملة من بروتينات المضيف التعبير عنها. ومن الصعب وخاصة إذا كان العامل المسبب هو زراعتها مثل phytoplasma. يوفر هذا البروتوكول إرشادات خطوة بخطوة لتنقية الحمض النووي من محطة المصابة phytoplasma المضيف الخشبية، والتضخيم من المستجيب المحتملين، وتحديد لاحق من شريك التفاعل الجزيئي المصنع مع شاشة Y2H. على الرغم من شاشات Y2H تستخدم عادة، هناك اتجاه الاستعانة بمصادر خارجية لهذه التقنية لشركات التقنية الحيوية التي تقدم خدمة Y2H في التكلفة. وينص هذا البروتوكول على تعليمات حول كيفية إجراء Y2H في أي مختبر البيولوجيا الجزيئية مجهز لائق باستخدام تقنيات المختبر القياسية.
Introduction
وقد وضعت الخميرة شاشات اثنين هجينة (Y2H) حوالي 27 سنوات قبل 1 ومنذ ذلك الحين استخدمت على نطاق واسع في مختلف المجالات لتحديد تفاعلات محددة البروتين البروتين 2، 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9، 10، 11 . التفاعل المادي للالمستجيب البكتيرية مع بروتين هدف المضيف وغالبا ما يكون شرطا مسبقا للتلاعب وظيفي من هذا البروتين الهدف. تحليل هذه التفاعلات قد انتقل إلى محورا للعديد من قطاعات مختلفة من العدوى الأحياء 12، 13، 14، 15،"> 16، 17، 18. إن مبدأ الشاشة Y2H هو أن التفاعل بين اثنين من البروتينات يؤدي إلى إعادة تشكيل عامل النسخ الوظيفي الذي يدفع التعبير عن الجينات المراسل. والمستجيب المعروفة (و" وتنصهر الطعم ") translationally إلى المجال الحمض النووي ملزمة (DBD) من عامل النسخ، وشركاء التفاعل المحتمل (و"فريسة") وتنصهر إلى المجال تفعيل (م) من عامل النسخ منها. ومنذ شريك التفاعل غير معروف، ومكتبة من إمكانات يتم استنساخ interactors إلى ما يسمى "مكتبة فريسة." وعادة ما يتم إجراء هذه المكتبة من قبل استنساخ cDNAs إلى ناقلات فريسة التعبير البلازميد المناسب ترميز م والتي تتوافق مع الطعم متجه المشفرة DBD. وفي حالة التفاعل، و عوامل النسخ المعاد لحث على التعبير عن الجينات المراسل، التي تمكن عموما اختيار نمو الخميرة. إنويتحقق تحديد interactors بواسطة التسلسل البلازميد فريسة مع الاشعال-بلازميد معين.
وقد طورت البكتيريا استراتيجيات مختلفة للتلاعب واستغلال الأيض المضيفة أو من الإفلات من آليات الدفاع وتفرز جزيئات المستجيب عبر مختلف أنظمة إفراز البكتيريا 19 و 20 و 21. تحديد الشركاء ملزم من هذه المؤثرات البكتيرية وبالتالي هو الخطوة الأولى في تحديد مسار التلاعب في البلد المضيف. وهذا يؤدي إلى تحسين فهم الآليات الإمراضية محددة.
يتم تنفيذ شاشات Y2H لتحديد التفاعلات المستجيب البكتيرية خلال phytoplasmoses، وكثير من الأحيان، Y2H هو التجربة الأولية الحاسمة لتوصيف مزيد من الآليات المرضية الجزيئية في مجال البحوث phytoplasma 22 و 23. ومع ذلك، فإن التقىوصف هود في معظم المنشورات نادرة إلى حد ما، وغالبا ما يتم الاستعانة بمصادر خارجية هذه التقنيات لشركات التكنولوجيا الحيوية. للفت الانتباه إلى جدوى هذه الطريقة، يوفر هذا البروتوكول المعلومات خطوة بخطوة لتحديد الشركاء التفاعل جزيء المستجيب البكتيرية في المضيف الطبيعي.
وعلى الرغم من الاستخدام الواسع ونهج سريع إلى الأمام من شاشات Y2H، فإنه يجب ألا ننسى أن بعض التفاعلات قد لا تحدث في نظام الخميرة. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن يتم استخدام خلايا الخميرة كنوع من "في الجسم الحي عاء التفاعل" مع بعض القيود البيولوجية هذه. وقد تناولت العديد من الكتاب مزايا وعيوب Y2H ومشتقاته 11، 24، 25، 26، 27. الاعتبارات العامة هي، على سبيل المثال، أن خلية الخميرة قد لا توفر المناسبالتعبير الجيني، (مرحلة ما بعد) متعدية، أو الظروف translocational للبروتينات منها قيد الدراسة. وهذا يمكن أن يؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة في الشاشة. تفاعلات إيجابية يمكن بدوره أن يكون القطع الأثرية وقد لا يحدث في الوضع الطبيعي (أي في حالة المؤثرات في المضيف المناسب). ومن ثم لا غنى عنه لتأكيد التفاعل من نظام الخميرة تعبير مغايرة مع اختبار تفاعل مستقلة في نظام بيولوجي أكثر ارتباطا.
في هذه الدراسة، تم تحديد الشركاء ملزم من ATP_00189 المستجيب من مسببات الأمراض النباتية غير الصالحة للزراعة Candidatus Phytoplasma مالي (P. مالي). توفر نتائج نظرة ثاقبة الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطور أعراض التفاح انتشار 28 عاما، وهو المرض الذي يسبب خسائر اقتصادية عالية في مناطق زراعة التفاح المتضررة في أوروبا 29.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الشاشة Y2H، وشارك في أعربت عن بروتين المستجيب محتمل مع مختلف البروتينات التفاعل افتراضية (الخطوة 7). يحتوي كل المتنامية استنساخ الخميرة الطعم ولكن (يحتمل) interactor لآخر. يتم ترميز البروتينات التفاعل في مكتبة [كدنا أن يتم استنساخ في البلازميدات فريسة. الطعم والفريسة البلازميدات كل رمز المشترك cistronically لجزء من عامل الخميرة النسخ. في حالة وجود التفاعل الجسدي بين الطعم (المستجيب) وفريسة interactor لترميز البلازميد، متحدون شطري عامل النسخ (المجال ملزم الحمض النووي ومجال التنشيط)، ويتسبب في التعبير الجيني مراسل. الخميرة هي قادرة على النمو على لوحات مختارة SD histidine- والمنضب الأدينين. هذا النوع من مكتبة [كدنا فريسة يتوقف على المستجيب فرزهم ويجب أن يتم اختيار وفقا لذلك. يجب أن يكون الموجه الفريسة والطعم، وكذلك سلالة الخميرة، متوافق. في هذه الشاشة، وLexA الحمض النووي المجال وتفعيل domai GAL4 ملزمن كانت تستخدم كوحدات عامل الخميرة النسخ المتوافقة. مكتبة [كدنا يمكن بناؤها بشكل فردي، العرف، أو الحصول عليها تجاريا. إعداد مكتبة فريسة كدنا] ليست جزءا من هذا البروتوكول. في هذا البروتوكول، واستخدمت لذلك، مكتبة [كدنا تطبيع بتشييدها من الحمض النووي الريبي من تفاح أوراق DOMESTICA x و المستنسخة في pGAD-HA 41. تحولت المستجيب (الطعم) -expressing الخميرة سلالة مع مكتبة فريسة، واختيرت الحيوانات المستنسخة على لوحات مختارة SD histidine- والمنضب الأدينين. لاستخراج DNA البلازميد من المستعمرات الخميرة، ينصح DNA البلازميد عدة القائم على عمود مصغرة للبكتيريا في تركيبة مع خطوة تعطل الميكانيكية باستخدام الخرز الزجاجي لتحسين الخميرة تحلل (الخطوة 8). في هذه تنقية البلازميد، سيتم تنقية الطعم وناقلات فريسة في وقت واحد في تركيزات منخفضة نسبيا. ومع ذلك، فإن كمية DNA البلازميد يكفي للتعرف على شريك التفاعل من خلال التسلسل خفة دمالحوت نشر البلازميد مسبق (الخطوة 8.4). وكبديل لذلك، الحمض النووي تنقيته في الخطوة 8.4 يمكن أن تتحول إلى المختصة كولاي واختار مع فريسة بوساطة ناقلات المقاومة للمضادات الحيوية (مثل الأمبيسلين وفي حالة pGAD-HA). هاء اختيار القولونية المستعمرات تحمل سوى مكتبة البلازميد pGAD-HA، وتنقية البلازميد ذات العائد المرتفع يمكن القيام بها مع هذه الحيوانات المستنسخة.
التحول الناجح لpLexA-N وpGAD-HA يبني يكمل التربتوفان ويسين auxotrophy من NMY51. التفاعل بين المستجيب وبروتين (المشفرة على pGAD-HA) يؤدي إلى تفعيل نظام مراسل في NMY51 السلالات. في حالة تفعيل الذاتي، NMY51 تحولت مع المستجيب معربا عن pLexA-N في تركيبة مع ناقلات مكتبة فارغة pGAD-HA تنمو على لوحات انتقائية تفتقر TRP-ليو-له-ADE، ويرجع ذلك إلى تفعيل غير المرغوب فيها من النظام مراسل NMY51 40. تفعيل الذات يمكن أن أكون wEAK ويمكن أن يحدث في غياب TRP-ليو-له، أو تفعيل يمكن أن تكون قوية وتميز بالنمو على لوحات TRP-ليو-له-ADE 41. تفعيل الذات يمكن أن يسبب خلفية ضخمة من الحيوانات المستنسخة إيجابية كاذبة في الشاشة Y2H الفعلية. لتجنب هذا، يجب إجراء اختبار الذاتي التنشيط مع الطعم، الذي ناقلات، معربا عن المستجيب هو-شارك تحولت مع ناقلات مكتبة فارغة. في هذا الإطار التجريبي، لا يجب أن يتسبب التعبير الجيني مراسل. إذا تفعيل الذات (أي نمو على لوحات مختارة) مرئيا في الاختبار، وسيلة يمكن أن تستكمل مع تركيزات مختلفة من 3 أمينو-1،2،4-التريازول 45 (3-AT). 3-AT هو المانع من نازعة الماء imidazoleglycerol فوسفات (HIS3)، وهو إنزيم مهم خلال الحامض الاميني الحيوي 46. مكملات مع 3-AT يمكن أن تقلل من تأثيرات ضعف تفعيل الذاتي خلال شاشات Y2H 47،48. يجب اختبار تركيزات مختلفة من 3-AT. في هذا البروتوكول، 1 – استخدمت 40 ملم 3-AT. يجب بعد ذلك يتم استخدام أقل تركيز الذي يؤدي إلى قمع تفعيل الذاتي في الشاشة Y2H. لا يمكن إلا أن لوحات مختارة من تفعيل الذات فحص يتم تقييم إذا لوحات SD-TRP-ليو من شارك في التحول تحتوي على عدد كاف من الحيوانات المستنسخة. باعتبارها ≥ إشارة 500 المستعمرات في 90 ملم (قطر) طبق بتري كافية. لتحديد كفاءة ترنسفكأيشن بالضبط، فمن المستحسن لإعداد التخفيفات المسلسل من الخميرة تتحول التعاون ونشرها على لوحات SD-TRP-ليو.
للحد من تفعيل الذات، والمستجيب يمكن المستنسخة في pLexA-C، ناقل التعبير الطعم الذي يجمع العلامة LexA لمحطة سي من البروتين. توجه ليكس-A علامة لا يمكن تخفف تفعيل مصيره (24). ومع ذلك، فإنه ليس من الممكن في كل حالة إلى خفض أو إلغاء تفعيل الذات. تشكيلالمستعمرات الحمراء أو المحمر يشير إلى التفاعل الضعيف أو كاذبة إيجابية. يتم تنشيط الجينات مراسل ade2 من NMY51 فقط عندما يتعلق الأمر تفاعل البروتين البروتين، والتي في كتل بدوره تراكم صبغة حمراء في هذه الخميرة سلالة 40. في حالة عدم وجود تفاعل، NMY51 هي المحمر، في حين المستعمرات تحمل interactors قوية بيضاء. مراقبة لون مستعمرة على لوحات مختارة وبالتالي يوفر تلميحا هاما آخر للحكم على ما إذا المستعمرات منها هي interactors true- أو إيجابية كاذبة.
ومن الضروري في نهاية المطاف على التكيف أو تغيير إعدادات الفحص معينة فيما يتعلق بطبيعة الطعم وخصائص التفاعل. الآن، وقد وضعت عددا من التحسينات والتقنيات مشتقة من Y2H مشتركة تتيح لتحليل التفاعلات البروتينية صعبة إلى حد ما في أنظمة المضيف مختلفة. مراجعة من قبل Stynen وآخرون. 49 عناوين ليصف الثانية جوانب مختلفة من Y2H، وإدخال تحسينات لها، والتكيف، وبالتالي يوفر معلومات مفيدة حول كيفية اختيار فحص التفاعل المناسب.
أصبحت شاشات Y2H والتقنيات المستمدة تستخدم على نطاق واسع في المجالات البحثية المختلفة، حيثما هو مطلوب تحديد تفاعلات البروتين الثنائية. حتى لو يتم تنفيذ الضوابط الحرجة، مثل اختبارات تفعيل الذات من الطعم واحد الى واحد إعادة التحولات من البروتينات المتفاعلة التي تم تحديدها، وY2H معرضة لإنتاج نتائج خاطئة 26، 50، 51. الخميرة كنموذج ليست مناسبة لجميع الدراسات التفاعل. الخميرة لا تشكل بالضرورة بيئة الخلوية التي تدعم التعديل المناسب بعد متعدية وقابلة للطي لكل بروتين 24. وعلاوة على ذلك، في الإعداد Y2H، البروتينات والإفراط في اعرب، والتعبير عنها ليس السيطرةبقيادة المروج الطبيعي. تجبر Y2H الشركاء التفاعل البروتينية إلى النواة، وهي ليست بالضرورة وجهة التحت خلوية الطبيعية. وبالتالي قد لا تعكس الظروف الخلوية الأم من التفاعل من قبل الخميرة ويمكن أن يؤدي إلى نتائج خاطئة سلبية أو إيجابية كاذبة. وتستند معظم Y2H على تكامل الخميرة auxotrophy كمبدأ انتقائية. يتميز هذا الاختيار الغذائية من قبل حساسية عالية، ولكن على حساب من الانتقائية انخفض بالمقارنة مع غيرها (على سبيل المثال، مراسل مولد اللون) فحوصات 49. إذا unreducible تفعيل الذاتي (انظر أعلاه) أو تحدث قيود أخرى لالمستجيب معين، وY2H ليست فحص المناسب 25. في الجدول 1 والشكل 1، وبالنظر إلى النتائج المتوقعة للاختبار الذاتي التنشيط. يمكن أن يكون سبب غياب التفاعلات الحقيقية (أي السلبيات الكاذبة) التي كتبها سمية بروتين، غير صحيح البروتين متعدية تجهيز والفراغية عائق للتفاعل والشركاء التفاعل ممثلة تمثيلا ناقصا في المكتبة تفترس غشاء توطين الطعم، أو في عداد المفقودين المكونات الضرورية للتفاعل 24.
فمن المستحسن أن دي نوفو تضخيم الجين كامل طول البروتين التفاعل تحديدها من كدنا]، subclone ذلك إلى pGAD-HA، وإجراء التفاعل فحص واحد الى واحد من خلال تحويل ولدت pGAD-HA بناء في، معربا عن الطعم NMY51 سلالة. وهذا أمر ضروري لأن interactor لاحظ موجودة في مكتبة فريسة قد تكون سوى جزء من بروتين أكبر. ومع ذلك، فإن المعلومات عن منهما الجين كامل طول يمكن الوصول إليها إلا إذا كبير الجيني وtranscriptomic تسلسل البيانات المتاحة. بروتوكول التحول للفحص الذاتي التنشيط الموصوفة هنا يمكن تطبيقها لمثل هذا الاختبار واحد الى واحد، والتفاعل بين الطعم وinteractor لويجب أن تكون قابلة للتكرار.
<p clالحمار = "jove_content"> التفاعلات التي تم تحديدها في شاشة Y2H يجب دائما أن أكده تقنية مستقلة أخرى. يجب أن يكون هذا الأسلوب مستقلة أقرب إلى بيئة طبيعية للالفعلي للتفاعل البروتين البروتين. في حالة ATP_00189 phytoplasmal المستجيب، تم التحقق من التفاعل مع عوامل النسخ TCP من تفاح س DOMESTICA في أخمص مع تكامل الفلورسنت ثنائي الجزيء (BiFC) في نيكوتيانا benthamiana جبلة مجردة 28 (ليست جزءا من هذا البروتوكول). وقد اشتق ATP_00189 البروتين المستجيب من محطة الممرض P. مالي. في بلانتا BiFC وهكذا اختارت أن تحقق التفاعل ATP_00189 مع تفاح س DOMESTICA عوامل النسخ التي سبق تحديدها في Y2H 28. BiFC هو البروتين البروتين التفاعل الفحص التي لا تتطلب النبات التحت خلوية من البروتينات التفاعل إلى النواة من أجل تفعيل نظام مراسل <سوب الطبقة = "XREF"> 52. علاوة على ذلك، في أخمص التعبير والآلات تعديل يحاكي بيئة من التفاعل الطبيعي بين المستجيب البكتيرية مصنع في مضيف مصنعها. ومع ذلك، فإن الشاشة العالمية باستخدام BiFC ليست مجدية.هناك العديد من الخطوات في البروتوكول التي يجب معالجتها بعناية. عندما تضخيم الجين (الخطوة 4)، من المهم أن يستبعد أن الاشعال ربط الحمض النووي المصنع. وبالتالي، من الحمض النووي من النباتات غير المصابة يجب أن تدرج كعنصر تحكم السلبية. يجب أن لا يحتوي على تسلسل الجين من مصلحة تقييد مواقع EcoRI وسالي التي تستخدم لاستنساخ اتجاهي للإدراج. إذا كان تسلسل لا تحتوي على هذه المواقع، يجب اختيار الانزيمات تقييد مختلفة لاستنساخ. التحول الخميرة هي طريقة المركزي خلال هذا البروتوكول. كفاءة ترنسفكأيشن يعتمد على كفاءة خلايا الخميرة، حيويتها، ولاية النمو، ونوعية reag ترنسفكأيشنوالأنف والحنجرة 53، 54. لالبروتوكول المقترح، فإنه ينصح بشدة لاستخدام الخميرة من لوحات جديدة لا يزيد عمرها عن أسبوعين (الاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية) عند تنفيذ التحولات. في كثير من الأحيان، تأخر نمو الخميرة تتحول عندما يتم تلقيح الثقافات السائلة انتقائية مع المستعمرات من لوحات أجار القديمة. ومن المفيد أيضا استخدام الثقافة بداية السائل بمثابة اللقاح للتجارب الفعلية وعدم استخدام الخميرة مباشرة من لوحة. انخفاض كفاءة عندما transfecting فريسة في الخميرة، معربا عن الطعم يمكن أن يؤدي إلى نقص تمثيل بعض البروتينات فريسة (interactors المحتملة)، وبالتالي يمكن أن تحرف الشاشة بأكملها. في هذا البروتوكول، وكفاءة ترنسفكأيشن خميرة ~ 150،000 وت م / ميكروغرام الحمض النووي transfected في Y2H عملت بشكل جيد.
معرفة عيوب وعيوب تقنية Y2H وتفسير النتائج بطريقة حاسمة ومناسبة أمر لا غنى عنه لرسم نيوسإلخ الاستنتاجات. وقد استخدمت المقايسات Y2H والمشتقات لسنوات عديدة، وخضعت العديد من التحسينات والتعديلات فيما يتعلق خصائص الطعم المختلفة، وتوطين التحت خلوية من التفاعل والشركاء ملزم المتوقع، وغيرها من العوامل التي قد تكون مطلوبة للتفاعل (انظر Y3H 55، 56، 57). في الآونة الأخيرة، وقد وضعت شاشات Y2H مجموعة مقرها التي تسمح للتحليل الآلي، والإنتاجية العالية من العديد من الطعوم ضد الملايين من يفترس 58. المستقبل على الأرجح يكمن في الأتمتة والإنتاجية العالية النهج لهذا الاختبار للسماح لاستجلاء مسارات الإشارات المعقدة وinteractomes في المجالات البحثية المختلفة.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر كريستين Kerschbamer، توماس Letschka، سابين Oettl، مارغو Raffeiner، وفلوريان Senoner من مركز البحوث Laimburg وMirelle بورخيس دياس Schnetzer من Dualsystems في مجال التكنولوجيا الحيوية AG للدعم التقني وجوليا ستروبل لتنقيح الكتابة المخطوطة. تم تنفيذ هذا العمل كجزء من مشروع APPL2.0 ويتم تمويلها جزئيا من قبل مقاطعة ذاتية الحكم لبوزن / بولزانو، إيطاليا وأبل اتحاد جنوب تيرول.
Materials
| Cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) | Applichem | A6284 | for DNA preparation |
| Trishydroxymethylaminomethane (Tris) | Applichem | A2264 | for media and buffer |
| Sodiumchloride (NaCl) | Applichem | A2942 | for media and buffer |
| Ethylenediaminetetraacetic acid Disodium salt (NaEDTA) | Applichem | A2937 | for media and buffer |
| N-Lauroylsarcosin sodium salt | Applichem | A7402 | for DNA preparation |
| ammonium acetate | Sigma-Aldrich (Fluka) | 9688 | for DNA preparation |
| 2-mercaptoethanol | Applichem | A1108 | for DNA preparation |
| Isopropanol (2-Propanol) | Applichem | A3928 | for DNA preparation |
| Ethanol | Sigma-Aldrich (Fluka) | 51976 | for DNA preparation |
| RNAse | Applichem | A2760 | for DNA preparation |
| Chloroform:Isoamyl 24:1 | Applichem | A1935 | for DNA preparation |
| Proofreading Polymerase (e.g. iProof) | Bio-Rad | 203433 | for PCR |
| EcoRI | Thermo Scientific | ER0271 | for cloning |
| SalI | Thermo Scientific | ER0641 | for cloning |
| Column-based DNA Purification Kit (e.g. QIAquick) | Qiagen | 28104 | for cloning |
| Kanamycin Sulfate | Applichem | A1493 | for microbiological selection |
| 3-Amino-1,2,4-Triazole (3-AT) | Sigma-Aldrich | A8056 | for self-activation assay |
| L-Arginine Monohydrochloride | Applichem | A3680 | for yeast culture |
| L-Isoleucine | Applichem | A3642 | for yeast culture |
| L-lysine Monohydrate | Applichem | A3448 | for yeast culture |
| L-Methionine | Applichem | A3897 | for yeast culture |
| L-Phenylalanine | Applichem | A3464 | for yeast culture |
| L-Threonine | Applichem | A3946 | for yeast culture |
| L-Tyrosine | Applichem | A3401 | for yeast culture |
| L-Uracile | Applichem | A0667 | for yeast culture |
| L-Valine | Applichem | A3406 | for yeast culture |
| L-Adenine Hemisulfate Salt | Applichem | A1596 | for yeast culture |
| 0.22 µm Pore Filter | Sartorius | 16541 | for sterile filtration |
| L-Histidine Monohydrochloride | Applichem | A3719 | for yeast culture |
| L-Leucine | Applichem | A3496 | for yeast culture |
| L-Tryptophane | Applichem | A3410 | for yeast culture |
| Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | 51483 | for yeast culture |
| D-Glucose Monohydrate | Applichem | A1349 | for yeast culture |
| Agar | Fisher Scientific | BP2641-1 | for yeast and bacteria culture |
| Peptone | Applichem | A2208 | for yeast culture |
| Polyethylene Glycol 4000 (PEG) | Applichem | A1249 | for yeast transformation |
| Lithium Acetate Dihydrate (LiOAc) | Applichem | A3478 | for yeast transformation |
| Salmon Sperm DNA | Applichem | A2159 | for yeast transformation |
| Antibody against Lex-A tag (e.g. Anti-LexA DNA binding region) | Millipore | 06-719 | for Western blot |
| Plasmid Miniprep kit (e.g. GenElute Plasmid Miniprep Kit) | Sigma-Aldrich | PLN350 | for plasmid purification from yeast and bacteria |
| Acid Washed Glass Beads | Sigma-Aldrich | G8772 | for plasmid purification from yeast |
| Ampicillin Sodium Salt | Applichem | A0839 | for microbiological selection |
| Yeast Extract | Applichem | A1552 | for yeast culture |
| Vacuum concentrator centrifuge (e.g. Concentrator 5301) | Eppendorf | Z368245 (Sigma) | for DNA preparation |
| Bait vector (e.g. pLexA-N) | Dualsystems | P01004 | for Y2H |
| Prey vector (e.g. pGAD-HA) | Dualsystems | P01004 | for Y2H |
| Control prey vector (e.g. pLexA-p53) | Dualsystems | P01004 | for Y2H |
| Control bait vector (e.g. pACT-largeT) | Dualsystems | P01004 | for Y2H |
| Electrocompetent E. coli (e.g. MegaX DH10B T1R Electrocomp Cells) | Invitrogen | C640003 | for cloning |
| Yeast reporter strain (NMY51:MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2::(lexAop)4-HIS3 ura3::(lexAop)8-lacZ ade2::(lexAop)8-ADE2 GAL4, e.g. NMY51) | Dualsystems | P01004 | for Y2H |
| Plastic paraffin film (e.g. Parafilm M) | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | for yeast and bacteria culture |
| Gas permeable sealer (e.g. BREATHseal) | Greiner | 676 051 | for yeast culture |
| PCR Cycler (e.g. T100 Thermal Cycler) | Bio-Rad | 1861096 | for PCR |
| quantitative PCR Cycler (e.g. CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System) | Bio-Rad | 1855195 | for quantitative PCR |
| Microcentrifuge (e.g. Centrifuge 5417 R) | Eppendorf | 5417 R | general lab equipment |
| Centrifuge (e.g. Centrifuge 5804 R) | Eppendorf | 5804 R | general lab equipment |
| Nuclease-free water (DNAse-free, RNAse-free, Protease-free) | 5Prime | 2500010 | for PCR and DNA works |
| Scalpell | Swann-Morton | 0301 | for DNA preparation |
| Sterile filter (0.22 µm; Polyethersulfone)) | VWR-International | 514-0073 (European Catalogue number) | for yeast and bacteria culture |
| Petri dishes Ø 90 mm | Greiner Bio-One | 633180 | for yeast and bacteria culture |
| Petri dishes Ø 150 mm | Greiner Bio-One | 639161 | for yeast culture |
| Photometer (e.g. BioPhotometer) | Eppendorf | 550507804 | for yeast culture |
| Photometer Cuvettes | Brand | 759015 | for yeast culture |
| Water Bath (e.g. Water Bath Memmert WB7) | Memmert | WB7 | for yeast transformation |
| Western Blot Equipment | Bio-Rad | diverse | for protein detection |
| dNTPs | 5Prime | 2201210 | for cloning |
| Shaker (Erlenmeyer) Flasks (100 ml; 1000 ml; 2000 ml) and breathable cotton plugs (e.g. Duran Erlenmeyer narrow-neck flasks) | Sigma Aldrich | Z232793, Z232858, Z232866 | for yeast and bacteria culture |
| Shaking Incubator (e.g. GFL 3031) | GFL | 3031 | for yeast and bacteria culture |
| Incubator | Binder | KB 53 (E3.1) | for yeast and bacteria culture |
| Ice Maker (e.g. Ice Maker IF 825) | Omniwash | IF 825 | general lab equipment |
| 0.2 ml, 1.5 ml and 2.0 ml Reaction Vials (Polypropylene) | Eppendorf | 0030.124.332 (0.2 ml); 0030.123.328 (1.5 ml); 0030.123.344 (2.0 ml) | general lab equipment |
| Pipettes and disposable pipette Tips (different volumina: 10-1000 µl) | Eppendorf | diverse | general lab equipment |
| Spreader | Sigma-Aldrich | SPR-L-S01 | for yeast and bacteria culture |
| Vortex shaker (e.g. MS 3 Minishaker) | IKA | 3617000 | general lab equipment |
| T4-Ligase | Thermo Fisher | EL0011 | for cloning |
| Fridge (4°C) (e.g. Liebherr Medline FKEX 5000) | Liebherr | 81.767.580.4 | general lab equipment |
| Freezer (-20°C) (e.g. Liebherr Comfort Professional G5216) | Liebherr | G5216 | general lab equipment |
| Graduated Cylinder (e.g. Brand) | Sigma Aldrich | Z327352; Z327417; Z327441 | general lab equipment |
| Serological Pipettes (e.g. Fisherbrand) | Thermo Fisher | S55701 | for yeast and bacteria culture |
| Mechanical Pipettor (e.g. Pipetboy acu 2) | Integra-Biosciences | 155000 | general lab equipment |
| Cuvettes for Electroporation (1 mm) | Molecular Bio Products | 5510-11 | for bacteria transformation |
| Electroporator (e.g. Eporator) | Eppendorf | 4309000019 | for bacteria transformation |
| Gel and Blot imaging system (e.g. ChemiDoc MP System) | Bio-Rad | 1708280 | general lab equipment |
| Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (50 ml) | VWR-International | 525-0403 (European Catalogue number) | general lab equipment |
| Conical centrifuge tubes (Polypropylene) (13 ml) | BD Falcon | 352096 | general lab equipment |
| Dithiothreitol (DTT, e.g. DTT, 1M) | Thermo Scientific | P2325 | for ligation |
| adenosine triphosphate (ATP, e.g. ATP Solution (10 mM)) | Ambion | AM8110G (distributed by Thermo Scientific) | for ligation |
| Dropout mix without histidine, leucine, tryptophan, and adenine (DO, e.g. Yeast Synthetic Drop-out Medium Supplements) | Sigma-Aldrich | Y2021 Sigma | for yeast culture (ready-made mix) |
References
- Fields, S., Song, O. -. K. A novel genetic system to detect protein-protein interactions. Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).
- Dombrosky-Ferlan, P. -. M., Corey, S. -. J. Yeast two-hybrid in vivo association of the Src kinase Lyn with the proto-oncogene product Cbl but not with the p85 subunit of PI 3-kinase. Oncogene. 14, 2019-2024 (1997).
- Singh, R. Rice Mitogen-Activated Protein Kinase Interactome Analysis Using the Yeast Two-Hybrid System. Plant Physiol. 160, 477-487 (2012).
- Lee, H. -. J., et al. Interaction of NADPH oxidase 1 with Toll-like receptor 2 induces migration of smooth muscle cells. Cardiovasc. Res. 99, 483-493 (2013).
- Del Bene, F., Tessmar-Raible, K., Wittbrodt, J. Direct interaction of geminin and Six3 in eye development. Nature. 427 (6976), 745-749 (2004).
- Kumar, A., Godwin, J. -. W., Gates, P. -. B., Garza-Garcia, A. -. A., Brockes, J. -. P. Molecular Basis for the Nerve Dependence of Limb Regeneration in an Adult Vertebrate. Science. 318 (5851), 772-777 (2007).
- Park, S. -. Y., et al. Abscisic Acid Inhibits Type 2C Protein Phosphatases via the PYR/PYL Family of START Proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
- Selyunin, A. S., et al. The assembly of a GTPase-kinase signalling complex by a bacterial catalytic scaffold. Nature. 469 (7328), 107-111 (2011).
- Uetz, P., et al. Herpesviral Protein Networks and Their Interaction with the Human Proteome. Science. 311 (5758), 239-242 (2006).
- Ushioda, R., Hoseki, J., Araki, K., Jansen, G., Thomas, D. Y., Nagata, K. ERdj5 Is Required as a Disulfide Reductase for Degradation of Misfolded Proteins in the ER. Science. 321 (5888), 569-572 (2008).
- Young, K. -. H. Yeast two-hybrid: so many interactions, (in) so little time. Biol. Reprod. 58, 302-311 (1998).
- Krachler, A. M., Woolery, A. R., Orth, K. Manipulation of kinase signaling by bacterial pathogens. J. Cell Biol. 195 (7), 1083-1092 (2011).
- Hewezi, T., Baum, T. J. Manipulation of Plant Cells by Cyst and Root-Knot Nematode Effectors. Mol. Plant Microbe Interact. 26 (1), 9-16 (2012).
- McGhie, E. J., Brawn, L. C., Hume, P. J., Humphreys, D., Koronakis, V. Salmonella takes control: effector-driven manipulation of the host. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 117-124 (2009).
- Kay, S., Bonas, U. How Xanthomonas type III effectors manipulate the host plant. Curr. Opin. Microbiol. 12 (1), 37-43 (2009).
- Navarro-Garcia, F., Serapio-Palacios, A., Ugalde-Silva, P., Tapia-Pastrana, G., Chavez-Dueñas, L. Actin Cytoskeleton Manipulation by Effector Proteins Secreted by Diarrheagenic Escherichia coli Pathotypes. Biomed. Res. Int. 2013, 22 (2013).
- Bhat, B. S., Shanaz, E. Effectors-Role in Host-Pathogen Interaction. J. Agr. Env. Sci. 3 (2), 265-285 (2014).
- Bhavsar, A. P., Guttman, J. A., Finlay, B. B. Manipulation of host-cell pathways by bacterial pathogens. Nature. 449 (7164), 827-834 (2007).
- Natale, P., Brüser, T., Driessen, A. -. J. -. M. Sec- and Tat-mediated protein secretion across the bacterial cytoplasmic membrane-Distinct translocases and mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes. 1778 (9), 1735-1756 (2008).
- Costa, T. R. D., et al. Secretion systems in Gram-negative bacteria: structural and mechanistic insights. Nat Rev Micro. 13 (6), 343-359 (2015).
- Tseng, T. -. T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 1-9 (2009).
- MacLean, A. M., et al. Phytoplasma effector SAP54 hijacks plant reproduction by degrading MADS-box proteins and promotes insect colonization in a RAD23-dependent manner. PLoS Biol. 12 (4), e1001835 (2014).
- Sugio, A., Kingdom, H. N., MacLean, A. M., Grieve, V. M., Hogenhout, S. A. Phytoplasma protein effector SAP11 enhances insect vector reproduction by manipulating plant development and defense hormone biosynthesis. Proc Natl Acad Sci. 108 (48), 1254-1263 (2011).
- van Criekinge, W., Beyaert, R. Yeast Two-Hybrid: State of the Art. Biol Proced Online. 2 (1), 1-38 (1999).
- Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology. Int. J. Mol. Sci. 10 (6), 2763-2788 (2009).
- Serebriiskii, I., Estojak, J., Berman, M., Golemis, E. A. Approaches to Detecting False Positives in Yeast Two-Hybrid Systems. Biotech. 28 (2), 328-336 (2000).
- Golemis, E. A., Serebriiskii, I., Law, S. F. The yeast two-hybrid system: criteria for detecting physiologically significant protein-protein interactions. Curr. Issues Mol. Biol. 1 (1-2), 31-45 (1999).
- Janik, K., Mithöfer, A., Raffeiner, M., Stellmach, H., Hause, B., Schlink, K. An effector of apple proliferation phytoplasma targets TCP transcription factors – a generalized virulence strategy of phytoplasma. Mol. Plant Pathol. , (2016).
- Strauss, E. Microbiology. Phytoplasma research begins to bloom. Science. 325 (5939), 388-390 (2009).
- Kartte, S., Seemüller, E. Variable response within the genus Malus to the apple proliferation disease. J. Plant Dis. Protect. 95 (1), 25-34 (1988).
- Bovey, R. Observations and experiments on apple proliferation disease. Phytopath. Mediterr. 2 (3), 111-114 (1963).
- Schlink, K., Reski, R. Preparing High-Quality DNA From Moss (Physcomitrella patens). Plant. Mol. Biol. Rep. 20, 423 (2002).
- Applichem. . N-Lauroylsarcosine sodium salt. , (2015).
- Applichem. . 2-Mercaptoethanol. , (2015).
- Applichem. . 2-Propanol. , (2015).
- Applichem. . Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1). , (2015).
- Mehle, N., Nikolić, P., Gruden, K., Ravnikar, M., Dermastia, M. Real-time PCR for specific detection of three phytoplasmas from the apple proliferation group. Methods Mol. Biol. 938, 269-281 (2013).
- Applichem. . Kanamycin sulfate. , (2015).
- Smith, L. M., et al. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nature. 321 (6071), 674-679 (1986).
- Lentze, N., Auerbach, D. Membrane-Based Yeast Two-Hybrid System to Detect Protein Interactions. Current Protocols in Protein Science. , 1917-1952 (2008).
- . Dualsystems Biotech AG. DUALhubrid Kit – Manual P01004 B06. www.dualsystems.com. , 1-44 (2012).
- Kurien, B. -. T., Scofield, R. -. H. . Protein Blotting and Detection. , (2009).
- Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat. Protocols. 2 (1), 31-34 (2007).
- . . Yeast Transformation and Cloning. , (2016).
- Sigma-Aldrich. . 3-Amino-1,2,4-triazole. , (2016).
- Ames, B. -. N. The Biosynthesis of Histidine: d-erythro-Imidazole-Glycerol Phosphate Dehydrase. J. Biol. Chem. 228, 131-143 (1957).
- Joung, J. -. K., Ramm, E. -. I., Pabo, C. -. O. A bacterial two-hybrid selection system for studying protein-DNA and protein-protein interactions. Prot Natl Acad Sci. 97, 7382-7387 (2000).
- Brennan, M. -. B., Struhl, K. Mechanisms of Increasing Expression of a Yeast Gene in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 136, 333-338 (1980).
- Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., van Dijck, P. Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 76 (2), 331-382 (2012).
- Hengen, P. -. H. Methods and reagents: False positives from the yeast two-hybrid system. Trends Biochem Sci. 22 (1), 33-34 (1997).
- Vidalain, P. -. O., Boxem, M., Ge, H., Li, S., Vidal, M. Increasing specificity in high-throughput yeast two-hybrid experiments. Methods. 32 (4), 363-370 (2004).
- Pattanaik, S., Werkman, J. -. R., Yuan, L., Yuan, L., Perry, E. S. Bimolecular Fluorescence Complementation as a Tool to Study Interactions of Regulatory Proteins in Plant Protoplasts. Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. , 185-193 (2011).
- Ito, H., Fukuda, Y., Murata, K., Kimura, A. Transformation of Intact Yeast Cells Treated with Alkali Cations. J. Bacteriol. 153 (1), (1983).
- Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi. Bioeng Bugs. 1 (6), 395-403 (2010).
- Bernstein, D. -. S., Buetr, N., Stumpf, C., Wickens, M. Analyzing mRNA-protein complexes using a yeast three-hybrid system. Methods. 26, 123-141 (2002).
- Stumpf, C. -. R., Opperman, L., Wickens, M. Analysis of RNA-Protein Interactions Using a Yeast Three-Hybrid System. Methods Enzymol. 449, 295-315 (2008).
- Cottier, S., et al. The yeast three-hybrid system as an experimental platform to identify proteins interacting with small signaling molecules in plant cells: potential and limitations. Front. Plant Sci. 2, 1-12 (2011).
- Häuser, R., Stellberger, T., Rajagopala, S. V., Uetz, P. Array-Based Yeast Two-Hybrid Screens: A Practical Guide. Two Hybrid Technologies: Methods and Protocols, Methods in Molecular Biology. , 21-38 (2012).
