효모 두 하이브리드 화면을 사용하여 비 경작 식물 병원체로부터 세균 이펙터의 기능을 해결했습니다

1. 감염된 사과 나무에서 뿌리와 잎 샘플을 수집 참고 : 병원체 특정 DNA가 뿌리 나 잎에서 정제 할 수있다. 다음 섹션에서는 모두의 샘플링을위한 프로토콜을 제공합니다. DNA의 준비를 위해 뿌리에서 시료 채취 및 준비 "애플 확산"특이 증상 (30), (31) 및 증상 무료 제어 나무와 감염된 나무를 식별합니다. 1cm 내지 5cm의 길이 – 깨끗한 전지 가위를 사용하여, 0.5 직경을 갖는 루트 샘플을 잘라. 루트 시스템의 세 가지 다른, 먼 사이트에서 컷 샘플은 적절하게 표시된 비닐 봉지에 넣어. 냉장 열 팩 추운 상자에 샘플을 유지하고 추가 처리 할 때까지 4 ° C의 냉장고에 보관. 참고 : 루트 아키텍처와 구조가 생리적 상태 오에 대해 다를 수 있습니다트리 바. 세 가지 다른 사이트에서 샘플 너무 얇은 작은 뿌리을하지 않는 것이 중요합니다. 샘플을 4 ° C에서 몇 일 동안 저장 될 수 있지만, 더 긴 저장 시간은 성형의 위험을 증가시킨다. 썩은 샘플 DNA의 제조에 이용 될 수 없다. 토양을 제거하기 위해 물을 뿌리 샘플을 씻어. 멸균 페트리 접시에 넣고 루트 표피와 피질을 제거하는 살균 메스를 사용합니다. 70 % (v / v)의 에탄올 수용액에 찍어 닦아 깨끗하고 보풀이없는 조직에 메스를 청소하고 불 (예를 들어, 분젠 버너)를 통해 열 소독. 멸균 2.0 ML의 반응 튜브에 다진 체관부 100 mg의 – (30), 메스와 체관부 스크래치 작은 조각으로 잘라하고, 나누어지는. 몇 달 동안 -80 ° C에서 샘플을 저장합니다. 샘플 수집 및 잎에서 준비 하는 감염과 증상이 컨트롤 트리를 확인의 단계 1.1.1.1에서 설명하고, 나무 당 열 상처 잎을 선택합니다. 조건에 따라 하나의 나무는 충분하다. 물에 잎을 씻어 70 % (v / v)의 에탄올 용액을 분사하여 표면을 청소합니다. 멸균 페트리 접시에 잎을 넣고 멸균 메스 각 잎의 주맥 (중심 정맥)을 해부하다. 의 주맥에서 표피와 피질을 제거 작은 조각으로 주맥을 절단하고, 멸균 2.0 ML의 반응 관에 주맥 조직의 나누어지는 100 mg을. 몇 개월 동안 -80 ° C에서 DNA 준비 또는 저장소에 대해 즉시 샘플을 사용합니다. 100 mg의 부분에있는 식물 재료 나누어지는 것이 편리하다 결국 저장을 동결 :합니다. 각 분취 직접 DNA의 제조에 이용 될 수있다. 냉동 식물 재료는 덩어리를 형성하는 경향이 있기 때문에 깊은 냉동 식물 재료를 계량하는 것은 번거 롭다. 2. 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드 (CTAB)는 DNA 제조 기반 <p class = "jove_content"는> 주 : DNA는 식물 재료에 대한 열 기반 DNA 정제 방법을 사용하여 정제 할 수있다. 이 섹션에서는 DNA 정화용 CTAB 기반 방법을 설명한다. DNA의 정제는 32 곳에 기재된 변성 프로토콜에 기초하여 수행된다. 다음 버퍼를 준비합니다 CTAB 버퍼 (: 364.45 g / 몰 CTAB, M 연구)를 100mM 트리스 히드 록시 메틸 아미노 메탄 (트리스, M의 R : 121.14 g / ㎖), 1.4 M 염화나트륨 (NaCl을, M의 R : 58.44 g V의 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드 / w 1 % 녹여 / 몰), 20 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산이 나트륨 염 (NaEDTA, M의 R : 372.24 g / mol)을 물하고는 pH를 8.0으로 조정한다. N-Lauroylsarcosine 버퍼 :와, 100 mM 트리스, 물에 20 mM의 NaEDTA 8.0으로 pH를 조절 : N-lauroylsarcosine 나트륨 염 (33) (293,38 g / 몰 M r에) V / w는 10 %를 녹여. 트리스 EDTA (TE) 버퍼 : 물과 autocl 10 mM 트리스 및 1 mM의 NaEDTA을 녹여솔루션을 들이죠. 초산 암모늄 용액 : 물에 솔루션 120 ° C에서 그것을 압력솥 20 분 동안 1.2 바 : 5 M 암모늄 아세테이트 (77,0825 g / 몰 M의 r)을 준비합니다. CTAB 완충액 300 μL, N-Lauroylsarcosine 버퍼의 30 μL, 테 K의 6 μL의 (10 μg의 / μL) 12 μL 신선한 또는 냉동 다진 식물 재료 (단계 1.1.2.2.) 100 mg의 – 30 믹스 2- 머 캅토 에탄올 (34) (M 연구 : 78,13 g / 몰). 60 ° C에서 60 분 동안 흔들어. 믹스 진행하기 전에 실온으로 냉각 할 수 있습니다. 초산 암모늄 용액 360 μL를 추가하고 적극적으로 섞는다. 용액을 5 분 동안 앉아하고 실온에서 10 분 동안 15,000 × g으로 원심 분리하여 그것을하자. 깨끗한 유리 병에 뜨는을 전송하고 얼음처럼 차가운 이소프로판올 (35)의 720 μL를 추가합니다. -20 ℃에서 적어도 30 분 동안 DNA를 침전. 4에서 30 분 동안 15,000 × g으로의 혼합을 원심C를 ° 상층 액을 버린다. 얼음처럼 차가운 70 % 에탄올 500 μL로 펠렛을 씻고 4 ° C에서 5 분 동안 15,000 XG에 그것을 스핀 다운. 에탄올 뜨는을 취소하고 즉시 잔류 방울을 제거하기 위해 깨끗한 종이 타월에 유리 병을 찍어. 가능한 한 많은 액체를 제거해야합니다. 15 ~ 20 분 동안 또는 진공 농축 원심 분리기에서 2 ~ 3 분 동안 펠렛을 공기 – 건조. 과잉 난방 또는 확장 증발 배 펠렛을 지나치게 건조하지 마십시오. TE 완충액 700 μL에 펠렛을 재현 탁하고 결국 용해를 촉진하기 위해 37 ° C로 가온. 의 RNAse 10 μL (10 μg의 / μL)를 추가하고 300 rpm으로 떨고, 37 ° C에서 15 분 동안 그것을 품어. 이소 아밀 알코올 36 24 : 1을 잘 섞는다 클로로포름 700 μL를 추가합니다. 39 ° C에서 10 분 동안 20,000 XG에서 혼합 원심 분리하고 새로운 깨끗한 바이알에 상청액의 상부 위상을 옮긴다. 추가하여 상등액의 DNA를 침전(: 60.1 g / 몰 이소프로판올, M의 R) -20 ℃에서 적어도 30 분 동안 배양하고, 2- 프로판올 (35)의 700 μL. 4 ° C에서 30 분 동안 12,000 XG에서 혼합 원심 분리하고 상층 액을 버린다. 4 ℃에서 5 분 동안 12,000 XG에 70 % 에탄올 및 원심 분리기 500 μL와 펠렛을 씻으십시오. 단계 2.5에 기재된 바와 같이 펠렛을 건조. TE의 50 μL에 용해. PCR 3. 감지 Candidatus 피토 플라스마 말리 특정 DNA 클레아없는 물에 식물 재료 1:10 내지 정제 DNA를 희석하고 병원균 특이 적 프라이머 (37)와 PCR을 실행합니다. P. 말리 피토 플라스마 (37)에 대한 프라이머 및 프로브를 특정 정량적 PCR 프로토콜을 사용하여 식물 재료의 P. 말리 특정 DNA의 존재를 확인한다. CA의 각 프로브와 동일한 PCR을 수행하여 다른 16SrX의 피토 플라스마 부재의 유무를 확인차. P.의 prunorum와 모시합니다. P. 피리 DNA 37. 참고 : 비 감염된 나무에서 DNA는이 컨트롤에서 병원체의 부재를 확인뿐만 아니라 테스트해야합니다. 이 단계에서, 그것이 P. 말리 이외 피토 플라스마 종으로부터 증폭 이펙터의 위험을 증가시킬 것이기 때문에 다른 관련성 피토 플라스마 종의 DNA가 시료에 존재하지 않는 것이 중요하다. 다른 밀접하게 관련된 P. 말리 16SrX 그룹 피토 플라스마와 혼합 감염은 각각 프로브로 시료를 분석해서 배제한다. 예상되는 결과가 다른 16SrX의 피토 플라스마 부정적되어야하기 때문에, PCR 효능을 나타내는 적절한 양성 대조군을 포함하는 것이 중요하다. 4. 잠재적 인 이펙터 유전자를 증폭 Y2H 미끼 벡터에 서브 클로닝 프라이머 5를 사용 말리 P.의 phytoplasmal 유전자 atp_00189 (신호 펩티드 부분을 포함하지 않음)를 증폭-TCTCCTCCTAAAAAAGATTCTA -3- (정방향) 및 5- TATTATTTATCTTTATTTTTTTCCTT -3- (후진)을 각각 5 '과 3'말단에서의 EcoRI 및 SalI에 대한 제한 부위와. 열 기반 DNA 정제 방법과 PCR 생성물을 정제 하였다. 를 EcoRI 및 SalI로 결찰을 통해 Y2H 미끼 벡터 pLexA-N에 앰플 리콘을 복제. 참고 : 여기,를 EcoRI 및 SalI로 100 NG는 pLexA-N 벡터 유사 PCR 증폭 물과 1 U T4-리가 atp_00189 소화 15 NG와 결합 된 선형화. 결찰은 (25 ℃에서의 pH 7.9) 40 mM 트리스 – 염산을 함유하는 완충액에서 수행 하였다 된 10 mM의 MgCl 2, 10 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT, M의 R : 154.25 g / mol)를 0.5 mM의 아데노신 삼인산 (ATP, M R : 16 ° C 하룻밤 (14-20 시간)에서 10.0 μL의 총 부피 507.18 g / 몰). 아 X domestica에 결합 불특정 프라이머를 배제하기 위해 동일한 프라이머와 감염되지 않은 트리에서 DNA를 분석 </EM> DNA. E. 콜라이 electrocompetent 세포로 결찰 믹스 1 μL 변형 및 루리아 – 베르 타니에 카나마이신 내성 클론을 선택 (LB) 플레이트를 50㎍ / ㎖의 카나마이신 설페이트 (38)로 보충. 제조업체의 지침에 따라 열 기반 플라스미드 미니 준비 키트를 사용하여 선택한 세균 클론의 플라스미드 DNA를 정제하고, 시퀀싱 (39)에 의해 삽입의 성공적인 통합과 방향을 확인합니다. 잠재적 인 이펙터 단백질의 자기 활성화 (자동 활성화) 5. 시험 다음 버퍼와 성장 미디어를 준비합니다 주 : 효모 선택적 판 하이픈의 명칭과, 각 매체의 누락 된 아미노산 약어는 "-"로 약칭하기 전에. 예를 들어, SD-TRP-레우 – 그의 판은 모든 아미노산하지만, TRP, 레우 자신이 포함되어 있습니다. 10 배 드롭 아웃 믹스 : 무게L- 아르기닌 염산염 200 mg의 (M 연구 : 210.66 g / mol)을, L 이소류신 300 mg의 (M 연구 : 131.17 g / mol)을, L – 리신 수화물 269 mg의 (M 연구 : 164.21 g / mol)을, L 메티오닌 200 mg의 (M r에 : 149.21 g / 몰), L- 페닐알라닌의 500 밀리그램 (M r에 : 165.19 g / 몰), L- 쓰 레오 닌 2 g (M r에 : 119.12 g / mol)을 300 mg의 L 티로신 (MR : 181.19 g / mol)를, L-우라실 (112.09 g / 몰) 200 ㎎, 및 L- 발린, 1.5 g (M 연구 : 117.15 g / 몰). 이중 증류수 1 L에 이들을 녹인 용액을 오토 클레이브. 4 ° C에서 솔루션을 유지합니다. 참고 : 각각의 드롭 아웃 믹스도 구입 혼합 될 수 있습니다. 10 배의 L-아데닌 보충 : L-아데닌 헤미 설페이트 염 (에이드, M의 R : 184.17 g / mol)을 100 mg의 무게를 두 번 증류수 50 ㎖에 용해. 필터는 0.22 ㎛의 세공 필터 솔루션을 살균. 10 배의 L 히스티딘 보충 : L – 히스티딘 염산염 일 수화물 100 mg의 무게 (자신, M r에 </suB> : 이중 증류수 필터 50ml에 209.63 g / mol)을 0.22 ㎛의 기공 필터로 멸균. 10 배 L 류신 부록 : 이중 증류수 50ml에 필터 0.22 μm의 기공 필터로 멸균 : L 류신 (113.17 g / 몰의 Leu, M의 R) 500 mg의 무게. 10 배의 L- 트립토판 부록 : 이중 증류수 50ml에 필터 0.22 μm의 기공 필터로 멸균 : L- 트립토판 (204.23 g / 몰 TRP, M의 R) 100 mg의 무게. SD-TRP-레우 – 그의 – 에이드 – 중간 플레이트 (아미노산없이) V 효모 질소베이스 / w 0.67 %를 용해 2 % w / V의 D-포도당 일 수화물 : 이중에서 (M r에 198.17 g / 몰) 물과 오토 클레이브를 증류. 한천 플레이트를 들어, w 2 % / 고압 증기 멸균 이전에 V 한천 (미생물 등급)를 추가합니다. 선택적 판을 준비, 멸균 SD-TRP-레우 – 그의 – 에이드 매체에 아미노산 원액의 1 배를 추가합니다. 판을 준비 할 때, 한천을 추가하기 전에 ~ 50 ° C로 냉각되어 있는지 확인아미노산. 멸균 주식 솔루션을 유지합니다. YPAD 매체 : (: 184.17 g / 몰 M r에), 및 / V 포도당 일 수화물에 w 2 % 1 V 효모 추출물 / w %, w 2 % / V 펩톤 (미생물 학년), w 0.004 % / V 아데닌 헤미 설페이트 염을 용해 물과 오토 클레이브를 두 번 증류. YPAD 한천 플레이트를 들어, V 한천 / w 전에 오토 클레이브에 2 %를 추가합니다. 배 YPAD을 제조하려면 전술 한 성분의 두배 농도를 사용한다. 참고 : 인해 매체에서 포도당의 높은 농도 (선택 사항), 배 YPAD 매체는 고압 증기 멸균 후 어두운 갈색이된다. 대체하는 40 % (W / V) 포도당 스톡 용액을 제조하고, 0.22 ㎛의 필터를 통과시켜 멸균 할 수있다. 필터 멸균 글루코스 스톡 용액을 무균 조건 하에서 멸균 배 YPAD (결여 글루코오스)에 첨가된다. 볼륨 오류를 방지하기 위해, 배 YPAD은 10 배 포도당 용액을 연속적으로 첨가되는 것을 염두에두고 준비해야합니다. 즉, 수단, 예를 들면, 1 대신 L 오 그F 매체 만 900 ㎖의 (글루코스를 제외한 모든 성분을 포함 함)을 제조하고 멸균 후 글루코스 원액 100㎖를 첨가한다. 테스트 자체 활성화를위한 리튬 아세테이트 매개 효모 변환 킬 사카로 마이 세스 세레 비지 기자 변형 NMY51 40 (NMY51 : MATahis3Δ200 trp1-901 leu2-3,112 ade2 LYS2 : :( lexAop) 4 HIS3 URA3 : :( lexAop) 8 lacZ의 ade2 : :( lexAop) 8 ADE2 GAL4)가에서 YPAD 한천 접시에 냉동 글리세롤 주식과는 30 ° C에서 48 시간 동안 그것을 품어. 이 판에서 식민지를 선택하고 YPAD 매체의 50 ㎖를 접종. 효모가 성장하고 성장을 모니터링하기 위해 정기적으로 OD 600을 측정 할 수 있습니다. 효모가 최종 OD 0.5-0.8의 600로 성장할 수 있습니다. 5 분 동안 700 XG에이를 원심 분리하여 세포 펠렛을 두 번 증류수, 멸균 물 2.5 mL에 그들을 재현 탁. 효모 현탁액 100 μL와 여섯 분취 량을 준비하고 50의 240 μL를 추가% W / V의 폴리에틸렌 글리콜 4000 (PEG, M의 R : 3,500-4,000 g / mol)을 1 M 아세트산 리튬 이수화 물 36 μL (LiOAc, M의 R : 102.02 g / 몰) 및 / V w 2 % 25 μL 연어 정자 DNA (용해). 두 번 증류, 멸균 모든 시약을 준비합니다. 다음 플라스미드 벡터 DNA를 "A"에서 "F"로부터 효모 현탁액을 포함하는 여섯 개의 바이알을 레이블 추가 네거티브 컨트롤 : (a) 1.5 이펙터 (pLexA-N-atp00189 28)와 미끼 플라스미드 μg의 (b) 빈 먹이 플라스미드의 1.5 μg의 pGAD-HA (41), (c)는 빈 미끼 벡터의 1.5 μg의 pLexA-N (41), 및 (d) 1.5 빈 미끼 벡터 pLexA-N의 μg의 빈 먹이 플라스미드 pGAD-HA의 1.5 μg의; 양성 대조군 (전자) 양의 제어 미끼 플라스미드 DNA pLexA-p53의 41 포지티브 먹이 플라스미드 협정-largeT (41)의 1.5 μg의 1.5 μg의; 및 자기 활성 시험 (F) BA 1.5 μg의그것은 이펙터 (pLexA-N-atp00189)와 빈 먹이 플라스미드 pGAD-HA의 1.5 μg의 플라스미드. 적극적으로 반응을 혼합하고 물을 욕조에 42 ℃에서 45 분 동안 그들을 품어. 700 XG에 5 분 동안 세포를 펠렛과 상층 액을 버린다. 다음 선택적 플레이트에 50 μL 확산 (48.44 g / 몰의 NaCl, M의 R) 및 0.9 %의 250 μL (w / v)의 염화나트륨 용액 중에 세포를 재현 탁 SD-TRP SD-레우, SD-trp- 레우, SD-TRP-레우 – 자신의, 그리고 SD-TRP-레우 – 그의 – 에이드. 30 ° C에서 4 일 – 3 판을 품어. 배양 1 일 이후에, 마르지 판을 방지하기 위해 플라스틱 파라핀 필름 번호판을 봉인. 접시에 효모의 성장을 확인합니다. 6. 테스트 이펙터의 식 이펙터 때의 N 말단에 연결되어 렉스-A 태그에 대한 항체로 웨스턴 블롯 (42)에 의해 조작자의 발현 테스트pLexA-N에서 표현했다. 주 : 병진 융합 렉스-A 태그는 관심있는 단백질의 실제 중량이 약 24 kDa의 추가 것을 고려한다. 웨스턴 블롯에서 단백질의 크기를 식별 할 때 중요하다. 7. Y2H 화면 킬은 pLexA-atp00189 (이펙터)는 신선한 SD-TRP 플레이트에 NMY51을 -transformed하고 2 성장하자 – 빨간색 식민지가 나타날 때까지, 30 ° C 3 일. 한천 플레이트에서 빨간색 식민지 작은 진탕 플라스크에 SD-TRP 매체의 3 mL의 접종 120에서 진탕 30 ° C에서 밤새 품어 – 150 rpm으로. 밤새 문화 1 mL를 진탕 플라스크에 SD-TRP의 20 ㎖를 접종하고 8 시간 동안 성장할 수 있습니다. SD-TRP 매체를 추가하여 600 = 0.2 중독 및 스타터 문화 각 10 mL로 플라스크를 흔들어에서 배 100 mL로 접종하는 문화를 조정합니다. 30 ℃에서 진탕 하룻밤 성장. 참고 : 효모 6 중독에 성장하지 않는 것을 확인하십시오00> 0.5과 신선한 SD-TRP로 희석. 외경 600 펠렛 (120) OD 600 측정 '단위를. " 600 1.2의 OD를 측정하는 경우, 예를 들어, 100 ㎖ 스핀 다운 상등액을 폐기하고 자기 교반 막대 진탕 플라스크에 미리 가온 배 YPAD 800 ㎖의 펠렛을 재현 탁. , 2 ML의 나누어지는 스핀 다운 뜨는을 제거하고 물에 펠렛을 재현 탁. 효모 현탁액의 OD 600이 0.15과 0.2 사이에 있는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우, 2 배 YPAD으로 조정하거나 야간 문화에서 더 많은 효모를 추가합니다. 주 : 배 YPAD 암갈색이고 OD 측정 결과에 영향을 미칠 수있다. 따라서, OD를 결정하기 전에 물에 효모 세포를 재현 탁시킬 필요가있다. 배지의 어두운 착색을 방지하는 단계 5.1.8 참고로 설명 된 바와 같이 대안 적으로, 2 × YPAD는 별도로 글루코스 멸균함으로써 제조 될 수있다. 앱에 남아있는 효모 문화를 품다ropriately (2 L 진탕 플라스크에 800 mL의 또는 두 개의 1 L 진탕 플라스크에 2 × 400 mL로 분할) 진탕 플라스크 크기의 30 ° C, 120 부화 – 150 rpm으로. 0.6 (600)에 도달하는 OD (- 6 시간 4 소요)까지 매일 1.5 시간에 대한 OD 600을 측정합니다. 한편, 다음 단계에서 설명 된 솔루션을 준비한다. 리튬 아세테이트 – 매개 형질 전환 물 V 연어 정자 DNA / w 2 %를 용해시키고, 100 ℃에서 수욕에서 5 분 동안 500 μL를 끓인다. 2 분 동안 얼음에 튜브를 넣고 가열 단계를 반복합니다. 더 사용할 때까지 얼음에 DNA를 유지합니다. 다음 믹스를 준비합니다 : TE / LiOAC 믹스 : 멸균 두 번 증류수 21.84 mL의 1 M LiOAC의 3.08 mL의 100 mM 트리스의 3.08 ㎖ / 10 mM의 EDTA (7.5 산도)를 섞는다. PEG / LiOAc 믹스 : 및 PEG 4000 (/ V w) 50 %의 33.6 mL의 1 M LiOAc 4.2 mL를 mM 트리스의 4.2 ㎖ / 10 mM의 EDTA (7.5 산도)를 결합합니다. 원심 분리기 800 mL의 효모 문화 (OD 600 = 0.6)700 XG에서 5 분 세포를 펠렛하기 위해. 상등액을 제거하고 살균 이중 증류수 200 ml에 펠렛을 재현 탁. 5 분 700 XG에 다시 펠렛은 세포와 상층 액을 버린다. 참고 : 원심 분리에 대한 몇 가지 병에 필요한 분할하면 정지. 7.7.3에서 액체 볼륨. 및 7.7.4. 800 mL의 현탁액에서 파생 된 전체 펠릿을 참조하십시오. TE / LiOAc 혼합물 16 ㎖의 펠렛을 재현 탁하고 (단계 7.7.1.1 참조); 5 분 700 XG에 스핀 다운 및 상층 액을 버린다. TE / LiOAC 믹스의 9.6 ㎖의 펠렛을 재현 탁. pGAD-HA-의 cDNA 라이브러리 벡터의 7 μg의 12 유리 병, 2 % 연어 정자 DNA (단계 7.7 참조)의 100 μL, 및 PEG / LiOAc 믹스의 2.5 mL의 다음 반응은 적절한 크기의 반응 폴리 프로필렌 선박에 혼합 준비합니다. 12 병의 각 단계 7.10에서 효모 세포 현탁액 600 μL를 추가하고 1 분 동안 격렬하게 혼합한다. 수조의 30 ° C에서 45 분간 반응 혼합물을 인큐베이션격렬하게 15 분마다 혼합 거라고. 모든 바이알에 DMSO 160 μL를 추가하고 적극적으로 섞는다. 42 ° C에서 또 다른 20 분 믹스를 품어. 5 분 700 XG에 펠렛은 세포 상층 액을 제거하고 배 YPAD 3 mL에 각각의 펠렛을 재현 탁. 수영장 모두 100 mL로 진탕 플라스크에 (12 병에서 36 mL의 총에) 세포는 30 ° C에서 90 분, 120 rpm으로의 효모를 배양한다. 700 XG에 5 분 동안 세포를 펠렛과 상층 액을 버린다. 염화나트륨 (V / w) 멸균 0.9 %의 4.5 mL에 펠렛을 재현 탁하고 10 ㎖의 혈청 피펫 조심스럽게 피펫 팅에 의해 아래로 잘 섞는다. 50 μL를 철회하고 열배 일까지 1:10 내지 0.9 %의 NaCl에서 희석 준비 : 1,000. SD-TRP-레우 한천을 포함하는 90 mm 배양 접시에 각 희석의 플레이트 100 μL. SD-TRP-레우 – 그의 – 에이드 한천과 16 X 150 mm 직경의 페트리 접시에 희석 효모 재 부유의 나머지 부분을 확산. 자기 활성화를 줄이기 위해 중간에 3-AT를 추가합니다. 는 SD-TRP-레우을 품어30 ° C 네 일 3 일 동안 판과 SD-TRP-레우 – 그의 – 에이드 판. 참고 : 선택적 판에 표시 클론 (전위) 상호 작용 쌍이며 미끼 상호 작용 파트너에 대한 pGAD-HA 플라스미드 코딩을 수행한다. 는 SD-TRP-레우 선택 판에 다른 일련 희석의 식민지를 계산하여 형질 전환 효율을 결정합니다. 따기와 신선한 SD-TRP-레우 – 그의 – 에이드 선택적 접시에 멸균 피펫 팁과 식민지 줄무늬에 의해 각 클론을 전송합니다. 30 ° C에서 24 시간 동안 번호판을 품어. 다섯 구절의 총에 도달 할 때까지 매일이 단계를 반복합니다. 선택적 플레이트에서 클론의 8 분석 멸균 후드 아래에 각 복제에 대한 SD-TRP-레우 – 그의 – 에이드의 1 mL를 한 멸균 2 mL의 반응 튜브를 준비합니다. 뜨거운 바늘로 각각의 튜브에 구멍을 펀치와 가스 투과성 실러의 조각으로 구멍을 커버합니다. 신선한 식민지 동료와 각각의 유리 병을 접종 150 rpm으로 떨고, 30 ° C에서 24 시간 동안 배양 하나 클론 (5 번째 통로 후 클론을 사용하는 단계 7.17)에서 리얼. 참고 : 4 ° C에서 며칠 동안 저장 판에서 촬영 효모 액체 배지에서 24 시간 내에 충분히 성장하지 않기 때문에 그것은, 새로운 판에서 클론을하는 것이 중요합니다. 4,000 XG에서 5 분 동안 효모 펠렛과 상층 액을 버린다. (각각의 플라스미드 DNA 미니 프렙 키트) 적절한 재현 탁 버퍼에 펠렛을 재현 탁하고 신선한 2.0 mL로 반응 관에 옮긴다. 산 세척 유리 구슬 (425- 600 μm의 직경)의 100 μL를 추가하고 5 분 동안 격렬하게 혼합한다. 각 용해 버퍼를 추가하고 제조업체의 지침에 따라 플라스미드 준비 미니 키트를 사용하여 플라스미드 정제를 진행합니다. 물 50 μL로 플라스미드 DNA를 용출시킨다. 먹이 플라스미드 특정 프라이머, GAL4ADseq과 시퀀싱 반응 단계 8.3에서 DNA를 사용하여심판 "> (41) 5' ACCACTACAATGGATGATG -3 '. 에 의해 상호 작용을 확인 드 노보 공동 변환 (43), (44) 미끼와 먹이 벡터. SD-TRP-레우 – 그의 – 에이드 선택 접시에 형질 전환 효모를 선택합니다.