Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

1. Tek Hücreleri İzolasyon microaspirator hazırlayın aspiratör tüp montajı net plastik ucunu çıkarın ve 3/16 "iç çaplı bir 1 metrelik PVC boru bir ucunu dar ucunu. 3/6 "iç çapı 1 metrelik PVC boru diğer ucunu bir 0.2 mikron şırınga filtresi çıkışını takın. 5/16 "iç çapa sahip bir 6 inç uzunluğunda PVC boru donanımının bir ucuna 0.2 mikron bir şırınga filtreden girişini yerleştirin. İsteğe bağlı: yarısında 5/16 "iç çapı 6 inç uzunluğunda PVC boru kesin ve iki yarısı arasında bir in-line su tuzağı yerleştirin. 1 ml mezuniyet 5 ml plastik serolojik pipet kırmak ve 5/16 "iç çapı ile PVC boru açık ucunu kırık ucunu. Bir aspiratör borusu düzeneğinin esnek ucunda (şeffaf plastik uç içine 5 ml plastik serolojik pipet çıkışını takın) Çıkarmıştı. depolama için, steril bir plastik tüp ile aspiratör boru montaj kırmızı ağızlık kapsamaktadır. Bir Bunsen beki alev yakınında tüp orta getiren ve tüpün iki ucundaki gerilim uygulayarak 10-30 mikron iç çapı bir cam kılcal tüp dışarı çizin. iki potansiyel aspiratör iğneler oluşturmak için ortada çizilen tüp kırın. sadece bazı tüpler tek hücre toplamak için uygun bir iç çapı ile sona erecek birkaç tüpleri ile bu adımı yineleyin. depolama için, bir 15 cm'lik Petri kabındaki modelleme kil iki şeritler yerleştirin ve şeritler arasında aspiratör iğne sabitleyin. hücreleri seç Hücre tipine ve deney için uygun tek bir hücre süspansiyonu hazırlanır. Örneğin, bu gibi uygun bir ortam ihtiva eden bir konik tüp tripsinizasyon ve transfer hücreler tarafından insan fibroblast hücre hatları hasat hücreler olarak yapışmış olan hücrelerin hazırlanması için. Önce, sırasında ya dafter tek bir hücre süspansiyonu (o tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak için ne kadar sürer bağlı olarak), kurulum tüm genom amplifikasyonu için kaput hazırlanıyor. % 10 çamaşır suyu ile kaput, pipet kutuları ve pipet uçları yüzeyini aşağı Sprey ve bir kağıt havlu ile silin. % 70 etanol ile bu adımı yineleyin. 96 oyuklu bir PCR plaka, tek tek oyuklara tüm genom amplifikasyonu (WGA) kit su 8 uL ekleyin, her bir hücre için bir de sekanslanacak olan. Buz üzerinde 96 oyuklu bir doku kültür plakasının ve bir yerden bir kapakla 96 gözlü PCR plakası kapatılır. 15 cm'lik bir Petri kabı içinde 10 ml ortamı veya fosfat tamponlu tuz (PBS) 1000 hücreleri ekleyin ve kabına yapışan hücreler önlemek için buz üzerinde çanak yerleştirin. 10X objektif bir ışık mikroskobu buz kapak ile Petri kabındaki hücrelere ve 96 PCR plaka getirin. yavaşça th çizilmiş ucunu hafifçe vurarak aspiratör iğne açılmasını artırmaksert bir yüzeye e aspiratör iğne ucu kırılır şekilde. microaspirator açık ucunu aspiratör iğne geniş ucunu takın. mikroskop sahnede hücreleri içeren Petri kabı yerleştirin. Ağızda aspiratör kırmızı ağızlık yerleştirin. hücreleri içeren Petri kabı taşımak için aspiratör iğne ve diğer yandan taşımak için tek bir elinizi kullanın. Tek hücreleri tanımlamak sekanslanacak olan. ağız emme kullanarak, ortam veya PBS ~ 1-2 mcL ile birlikte aspiratör iğne içine tek bir hücreyi çizin. 96 gözlü PCR plaka tek bir kuyu içine su 8 uL hücreyi aktarın. hücreyi aktarırken kabarcıkları tanıtan kaçının. Hücrelerin istediğiniz sayı izole edilene kadar adımı tekrarlayın 1.2.7. buz üzerinde PCR plaka tutun ve toplama hücreleri arasındaki kapak ile örtülü. Hücreleri almış kuyu işaretleyin. tek hücre toplama ederken, bütün g 10X tek hücre parçalama ve parçalanma tampon çözülmeenome amplifikasyon kiti. hücrelerin istenilen sayıda toplama sonra, tüm genom amplifikasyonu hemen geçin. 2. Tüm Genom Büyütme , Tüm genom amplifikasyonu sırasında kirlenmesini önlemek bir doku kültürü kaput içinde tüm reaktifler ekleyin filtreleri ile pipet uçları kullanın ve kuyularda arasında pipet değiştirmek için. tüm genom amplifikasyonu (WGA) kiti bir çalışma parçalama ve parçalanma tampon çözeltisi hazırlayın. En fazla 32 hücrelerinin her biri için, bir mikrosantrifüj tüpü içinde, proteinaz K çözeltisi 10x tek hücre lisis ve parçalanma tamponu, 2 uL 32 uL birleştirir. çözümler karıştırmak için tüp Vortex. her oyuğa lizis ve parçalanma tampon çözeltisi çalışma 1 mcL ekleyin ve yukarı pipet ve aşağı karıştırın. plaka Kapak ve bir plastik filmle tüm kuyuları mühür. Kısaca mini plaka spinner tabak santrifüj. foll olarak Termal döngüakımları: 50 ° C, 1 saat ve 99 ° C, 4 dakika. buz üzerinde plaka soğutun ve kısaca mini plaka spinner tabak santrifüj. tüm genom amplifikasyon kiti çalışan bir kütüphane hazırlık tampon çözeltisi hazırlayın. her bir hücre için, 1 x tek hücre kütüphanesi hazırlanması tamponu, 2 ul ve mikrosantrifüj tüpü içinde bir kütüphane sabitleme çözeltisi 1 uL birleştirir. Aynı mikrosantrifüj tüpü içinde birçok hücreler için çalışma çözeltisi hazırlayın. plastik filmi çıkarın ve her bir kütüphane hazırlanması tampon çözeltisi çalışma 3 uL ekleyin. karıştırmak için iyi yukarı ve aşağı içeriğini pipetle. plastik film değiştirin. Not: Wells filmde delikler başlayana dek plastik film tüm genom amplifikasyonu süreci boyunca yeniden kullanılabilir. Bu durumda, yeni bir plastik film geçin. Kısaca, bir mini plaka spinner plaka santrifüj 2 dakika boyunca 95 ° C'de inkübe edin. buz ve kısaca plaka soğutunmini plaka spinner plaka santrifüj. Plastik filmi çıkarın her kuyuya 1 ul kütüphane hazırlık enzim ekleyin ve yukarı iyi içeriğini pipet ve aşağı karıştırın. buz üzerinde veya bu adımı boyunca soğuk bir blokta kütüphane hazırlık enzim tutun. plastik film değiştirin. 16 ° C, 20 dakika, 24 ° C, 20 dakika, 37 ° C, 20 dakika, 75 ° C, 5 dakika, 4 ° C 'de sabit: Kısaca aşağıdaki mini plakası döndürücü ve termal döngüsü içinde plaka santrifüj. buz üzerinde plaka soğutun ve kısaca mini plaka spinner tabak santrifüj. tüm genom amplifikasyon kiti bir çalışma amplifikasyon karışımı hazırlayın. Her hücre için, 48.5 ul su, 7.5 ul 10x büyütme ana karışımı ve bir mikrosantrifüj tüp içinde 5 uL WGA DNA polimeraz birleştirir. Aynı mikrosantrifüj tüp içinde birkaç hücreler için çalışma karışımı hazırlayın. buz üzerinde çalışan karışımı tutun. Plastik filmi çıkarın amplifikasyon karışımı çalışan 61 mcLde yukarı ve aşağı her sıra ve pipet içeriğine karıştırın. buz üzerinde veya bu adımı boyunca soğuk bir blokta çalışan amplifikasyon karışımı tutun. plastik film değiştirin. 95 ° C, 3 dakika, 94 ° C'de 25 döngü, 30 saniye 65 ° C, 5 dak, 4 ° C 'de sabit: Kısaca şu şekilde mini plaka spinner plaka ve termal döngüsü santrifüj. 3. adımda kullanılmak üzere, 20 ° C – ayrı bir mikrosantrifüj tüpü ve saklamak için, her numune devri 60 uL. Her numune (örnek 15 uL, yani 3 uL 6x DNA yükleme boyası) geri kalan hacim DNA yükleme boyası ekleyin ve bir% 1 agaroz jeli üzerinde Her reaksiyondan 5 uL çalıştırın. NOT: başarıyla 250 ila 1,000 bp bir smear olarak görünür güçlendirilmiş hücreler. bir karalama göstermek veya sadece bir soluk smear görünmüyor numuneler yararlı sıralama verilerini elde etmek olası değildir. 3. Sıralama paramanyetik boncuklar ile örnekleri arındırın. ThaBuz üzerinde ağırlık DNA örnekleri. Çözelti homojen olması ve en az 30 dakika oda sıcaklığında inkübe boncuk Vortex para-manyetik boncuk kadar. Temiz bir mikrosantrifüj tüpü içine, her bir DNA numunesi 20 uL aktarın. Numunenin geri kalan kısmı, -20 ° C'de saklanabilir. Her DNA örneği ve karıştırmak için vorteks paramanyetik boncuk 30 mcL (1.5x) ekleyin. 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Aşama 3.4 kullanılmak için oda sıcaklığında boncuk stok solüsyonu bırakın. 2 dakika süreyle manyetik tüp şerit üzerinde tüpler yerleştirin veya boncuk bir pelet oluşturur ve kadar süpernatant açıktır. P200 pipet kullanarak, boncuk bozmadan mümkün olduğunca süpernatant kadar kaldırın. DNA boncuk karışımı% 80 etanol içinde 180 uL ekleyin. boruları etanol çözeltisi ile boncuk "durulama" mıknatıs göre birkaç kez çevirin. P200 pipet kullanarak, çekmenin, aslında etanol yıkama kadar kaldırınboncuk bozmadan ble. 3.1.6 ve 3.1.7 tekrarlayın. Hava yaklaşık olarak 10 dakika ya da daha fazla etanol görünene kadar boncuk kurutun. boncuklar kırık görünür bir sonraki adıma geçin ya da tüpün duvarı düşmek. manyetik şerit örnekleri çıkarın. boncuklardan DNA elüte boncuk tekrar süspansiyon örnekleri girdaba 10 mM Tris pH 8.0, 40 uL ekleyin. Oda sıcaklığında 2 dakika süreyle inkübe edilir. Kısaca tüpün altındaki sıvı toplama ve en az iki dakika için bir manyetik şerit üzerinde boru tüpleri örnekleri santrifüj. boncuk bozmadan temiz mikrosantrifüj tüpler içine eluent aktarın. örnek normalleştirme Bir spektrofotometre kullanılarak, her bir numune konsantrasyonunu belirlemek. konsantrasyonları 10 ile 30 ng / ml aralığında olmalıdır. 10 mM Tris pH 8.0 kullanılarak 0.2 ng / ml, her örnek seyreltilir. Aşağıdaki adımlar asgari i gerektirirBu seyreltme 5 uL Temel giriş. Kütüphane hazırlanması Kütüphane hazırlık seti 13 yönergeleri izleyerek sıralama kütüphaneleri hazırlayın. nihai temizleme Adım 3.1 göre örnekleri temizleyin. 50 bp, 75 bp, ya da 150 bp okuma uzunlukları sırasıyla 1.5x, 1x veya 0.6x hacmini örnek boncuk oranını kullanın. 10 mM Tris pH 8.0 15 ul ile elüte. Kütüphanede 14 boyutu dağılımını kontrol etmek için bir parçası analizörü örnekleri çalıştırın. boyut dağılımı eşit 150 900 bp yayılmalıdır. qPCR kullanarak örnekleri sayısal olarak Kütüphane Niceleme Kiti kullanılarak, kit talimatlarına 15'e göre bir qPCR reaksiyon ayarlayın. Pozitif standartları (kit DNA standartları) ve negatif standartları (su veya başka boş çözelti) eklemek için bir sütun boş bırakın. fol olarak Termal döngüdüşükler: 95 ° C, 5 dakika (4.8 ° C / saniyenin altındaki bir rampa) ile 95 ° C, 30 saniye (4.8 ° C / saniyenin altındaki bir rampa) ve 2.5, 60 ° C, 45 saniye (rampa 35 döngü ° C / sn). havuzu akış hücresi üzerinde birçok şerit ihtiyaç vardır nasıl belirleyin ve hat başına bir grup ile, gruplar halinde örnekleri bölün. Numunelerin her bir grup için, aşama 3.5.2 arasında qPCR verilere dayanarak düşük konsantrasyon ile örnek seçmek ve 10 mM Tris pH 8.0 kullanılarak bu konsantrasyona kadar bu gruptaki tüm örnekleri normalleştirmek. birlikte, her grup örnekleri havuz. Ardışık Standart prosedürler 16 aşağıdaki nesil dizileme makinede yük havuzları. 4. Veri Analizi NOT: Unix tabanlı ortamda bu bölümde programları ve komut dosyalarını çalıştırmak için gereklidir. onların in aşağıdaki protokolde belirtilen yazılımı yükleyin enstalasyonda kılavuzları. Tüm komut https://sourceforge.net/projects/singlecellseqcnv/ bulunabilir. FASTX-Toolkit sürüm 0.0.13 17'den fastx_trimmer kullanarak 40-nt okur Trim. fastx_trimmer -Q33 -i example.fastq -l 40 -o example.trim.fastq Varsayılan seçenekleri 18 ile BWA sürüm 0.6.1 kullanarak uygun referans genomu (fare için MM9, insana hg19) okur hizalayın. bwa aln mm9.fa example.trim.fastq> example.sai bwa Samse mm9.fa example.sai example.trim.fastq> example.sam Daha sonra sıralamak ve endeks elde edilen BAM dosya SAMTools sürümü 0.1.19 19 kullanılarak, chrM ve rastgele kromozomlarına hizalamalarını çıkarın. grep -v -w chrM example.sam | grep -v rasgele> example.filtered.sam | Samtools -uSh example.filtered.sam görmek samtools sıralama – example.filtered samtools endeksi example.filtered.bam CNVs tespit HMMcopy başlat= "Xref"> 20 genomu için GC yüzdesi referans dosyası oluşturmak için HMMcopy içinde gcCounter kullanın. pencere boyutunu belirlemek için "500000 -w" seçeneğini kullanın. Adım 4.2 kullanılan Fasta referans dosyası aynı sürümünü kullanın, ancak emin chrM yapmak ve rastgele kromozomlar Fasta dosyadan kaldırılır. gcCounter -w 500000 mm9.fa> mm9_gc.wig mappability için kıpırdatmak dosyası oluşturmak için HMMcopy içinde generateMap.pl kullanın. uzunluğu okumak belirtmek için "40 -w" seçeneğini kullanın. Adım 4.4.1 kullanılan aynı Fasta referans dosyasını kullanın. generateMap.pl -b mm9.fa generateMap.pl -w 40 -i mm9.fa mm9.fa -o mm9.bigwig genomu için bir mappability referans dosyası oluşturmak için HMMcopy içinde mapCounter kullanın. pencere boyutunu belirlemek için "500000 -w" seçeneğini kullanın. mapCounter -w 500000 mm9.bigwig> mm9_map.wig Her BAM dosyası için bir kıpırdatmak dosyası oluşturmak için HMMcopy içinde readCounter kullanın. readCounter 500000 example.filtered.bam> input.wig -w </li> R komut dosyalarında referans dosyalarına yollarını değiştirmek (run_hmmcopy.mm9.r veya run_hmmcopy.hg19.r), 4.4.1 (örneğin, mm9_gc.wig) ve 4.4.3 (örneğin, mm9_map yukarıda oluşturulan dosyaları kullanabilirsiniz. sırasıyla, GC yüzdesi referans dosyası ve mappability referans dosyasına bakın değişkenler gfile ve MFILE için peruk). Sonra sağlanan R komut "run_hmmcopy.mm9.r" ya da "run_hmmcopy.hg19.r" çalıştırın. R CMD TOPLU run_hmmcopy.mm9.r veya R CMD TOPLU run_hmmcopy.hg19.r BAM dosyaları bir dizi toplu işlem için, (VS) segmentleri arama ve değişkenlik puanları hesaplamak için paketinde sağlanan komut "HMMpipe.pl" tek bir klasörde BAM dosyaları koymak ve çalıştırın. biçimi uygulayın: Perl HMMpipe.pl Folder_to_BAMfiles mm9 CNVs 21 tespit etmek için DNAcopy çalıştırın. benzersiz her BAM dosyasından okur eşlenen ayıklamak için SAMtools sürüm 0.1.19 kullanın. samtools görüntülemek -h -F 0x0004 example.filtered.bam | egrep -i "^ @ | XT A: U" | samtools -Shu görünümü -> example.mapped.bam BAM PCR çiftleri 22 dosya işaretlemek için Picard sürüm 1.94 yılında MarkDuplicates kullanın. MarkDuplicates.jar GİRİŞİ jar java = example.mapped.bam ÇIKIŞ = example.nondup.bam METRICS_FILE = example.dup REMOVE_DUPLICATES = true Sürüm 2.17.0 eşlenen sayısı için bedtools olarak coveragebed kullanımı sağlanmıştır YATAK dosyası "mm9.500k.dynamic.win.bed" ya da "hg19.500k.dynamic.win.bed" 23 önceden tanımlanmış dinamik 500kb eşlenebilir pencerelerinin her okur . coverageBed -abam example.nondup.bam -b mm9.500k.dynamic.win.bed -counts | sıralama -k1,1 -k2,2n> example.nondup.counts sağlanan GC içeriği referans dosyası "mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt" ya da "hg19.500k.dynamic.win.fa dayalı okuma sayar normalleştirmek için sağlanan Perl betiği" normalizeGC.pl "kullanın. gc.txt ". perl normalizeGC.pl mm9.500k.dynamic.win.fa.gc.txt example.nondup.counts> example.bam.norm.counts segmentleri aramak için sağlanan R komut "dnacopy.r" kullanın. R CMD TOPLU dnacopy.r CNVs tespit 4.4.6 hesaplanan VS 0.26 aştığı için hücreleri hariç. Hangi medyan günlük 2 oranı fazla 0.4 (farazi kazanç) ya da daha az -0.35 (varsayılan kayıp) sadece bu içerecek şekilde 4.4.6 HMMcopy tarafından çağrılan segmentleri Filtre. segmenti ortalama 0.6 daha fazla 1.32 veya daha az sadece bu hangi eklemek 4.5.5 yılında DNAcopy tarafından çağrılan segmentleri Filtre. Sadece HMMcopy ve DNAcopy hem farazi kazanç veya varsayılan kaybı tespit bölgelerde CNVs çağırarak, 4.6.2 ve 4.6.3 segmentleri örtüşüyor.