Canlı Görüntüleme Olgun Myofibers İn Vitro Farklılaşma içinde
Summary
Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.
Abstract
İskelet kas myofibers, büyük memeli vücudundaki hücrelerin ve çok az sinsitya birine oluşmaktadır. Nasıl oluşturan karmaşık ve evrimsel olarak korunmuş yapılar monte edilir soruşturma altında kalır. Onların büyüklüğü ve fizyolojik özellikleri genellikle manipülasyon ve görüntüleme uygulamaları kısıtlamaktadır. ölümsüzleştirilmiş hücre soylarının kültür yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak tek fark, erken aşamaları çoğaltabilir.
Burada, birincil fare miyoblastların kaynaklanan myofibers kolay genetik manipülasyon sağlayan bir protokol açıklar. farklılaşma, bir hafta sonra, myofibers kontraktilite hizalanır sarkomer ve üçlüleri, hem de periferal çekirdek gösterir. Tüm farklılaşma süreci canlı görüntüleme veya immünofloresan ile takip edilebilir. Bu sistem, mevcut ex vivo ve in vitro protokollerinde avantajlarını birleştirir. kolay ve etkin bir transfeksiyon olasılığı olaraktüm farklılaşma aşamaları erişim kolaylığı potansiyel uygulamalarını genişletmektedir. Myofibers sonra, ilgili gelişimsel ve hücre biyolojisi soruları için değil, aynı zamanda klinik uygulamalar için kas hastalığı fenotipleri çoğaltmak değil sadece kullanılabilir.
Introduction
İskelet kası, insan vücut ağırlığının 1% 40'a kadar oluşturur. Kas-ilişkili bozukluklar muazzam bir sağlık ve ekonomik yük 2 temsil etmektedir. Bu son derece karmaşık ve organize doku kurdu muhafaza ve yeniden nasıl bir kapsamlı ve köklü bir araştırma alanını oluşturur. 6 – Belirli bir bilimsel ilgi bağlı olarak, en uygun yaklaşım in vivo modellerde 3 basitten komplekse mihotüp kültürlerden uzanabilir.
Bu protokolün amacı canlı görüntüleme ve immünofloresans vasıtasıyla Miyogenesis izlenmesi için izin veren, bir in vitro sistem sağlamaktır. Geleneksel yöntemlere göre, bu sistem fare myojenik sürecine bir çok tam ve dinamik bir bakış sunuyor. Hücreler enine gizli suç şebekesi ve periferik çekirdekleri 7 görüntüleme olgun, çok çekirdekli myofiber için myoblast aşamasından takip edilebilir. Bu olgunlaşma düzeyi canKarmaşık uyarıcı veya mekanik aparatlar için gerek kalmadan normal hücre kültürü ekipman kullanılarak elde edilebilir. In vitro sistemlerde bazı başarılı 8,9 bildirilmiş olmasına rağmen, bildiğimiz kadarıyla, bu çapraz sarkoplazmik retikulum (SR) ile eşleştirilmiş T-tübüller olgun fare myofibers üreten tek protokoldür. Böylece, bu in vitro sistem hala zayıf 10 anlaşılamamıştır üçlü oluşumu moleküler mekanizmaları, incelemek için kullanılabilir.
Bu sistemi kullanarak bir başka avantajı, bu tür antikorlar, ilaçlar, ve RNAi araçları olarak doğrulanmış fare hedefli kaynaklar mevcudiyetidir. Nispeten basit bir protokoldür zahmetli adımlar, çok yetenekli manipülasyon, ya da pahalı ve özel ekipman gerektirmez. Olgun myofibers kalsiyum kıvılcım (yayınlanmamış veri) ile birleştiğinde kasılma göstererek, kültür farklılaşması 7 5 d sonra görünmeye başlayacak. Bir hafta içinde, farklı gelişimmemeli vücudundaki en karmaşık hücreler birinin ark aşamaları, in vitro bir dizi analiz ile kombinasyon halinde incelenebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Birincil miyoblastların yetiştirilmesi için bu protokolün kullanımı büyük ölçüde myofibers gelişimini besleyen özel bir niş yol açmaktadır. Bu da çok az sayıda bulunan diğer hücre tiplerine, kısmen bağlıdır. myoblast konsantrasyonu ve kültür saflığı arasında bir denge sağlanmalıdır. İyi bir hücre kültürü de orta formülasyon için kullanılan ürünlerin kalitesine bağlıdır. hayvansal kaynaklardan elde edilen bütün ürünler iyice test edilmelidir. Bizim tecrübelerimize göre, sindirim koşulları da takip edilmelidir.
Birincil kültürler için her zaman olduğu gibi, deneysel değişkenliği izole elyaflar ya da ölümsüzleştirilmiş miyoblastların olan çalışmalara göre daha yüksek olabilir. Bu değişkenlik orta ve sindirim bileşenleri, fareler ve boyutu ve kültür manipülasyon ve sonuçları toplanması için zaman noktalarında standardizasyonun azaltılabilir. Bununla birlikte, karmaşık mekanizmalar gerçek zamanlı olarak tetkik avantajımyofiber gelişimi için gerekli ölçüde değişkenlik dezavantajı geçti.
Bu protokol, hücre farklılaşmasını ödün vermeden, in vitro yaklaşımların avantajlar sağlar. triads oluşur ve kasılmalar kalsiyum kıvılcım birleştiğinde kadar Myofibers olgun. Bu fonksiyonel çıkışlar, farklı deneysel koşullarda ulaşılabilir. Ayrıca, protokole yapılan birçok teknik farklılıklar olabilir. Miyoblastlar kas gelişimi ile ilgili ilgi mutasyonlar ile neonatal fareden hasat edilebilir. Hücreler farklı farklılaşma zaman noktalarında biyokimyasal analiz için parçalanmış olabilir. Kalsiyum göstergeleri dinamiklerini takip etmek kültüre eklenebilir. Optogenetic yapılar bazı sinyal yolaklarını zorlamak için ya da belirli yerel tepkiler teşvik etmek için kullanılabilir. Son olarak, myofibers etkileşimlerini incelemek için, diğer hücre tipleri ile kültive edilebilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the European Research Council (ERG) and EMBO installation (ERG) and by a PhD fellowship from the Fundação para a Ciência e Tecnologia (MP).
Materials
| Dispase II | Gibco | 17105041 | |
| Collagenase type V | Sigma-Aldrich-Aldrich | C9263 | |
| IMDM, Glutamax supplemented | Gibco | 31980022 | |
| Matrigel Growth reduced factor | Corning | 354230 | protein concentration of the lot should be around 10mg/ml and endotoxin result should be <1.5 |
| Chicken Embryo Extract | MP biomedical | 2850145 | it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012)) |
| Recombinant rat agrin | R&D systems | 550-AG-100 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Horse Serum | GE Healthcare | 11581831 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | used to transfect siRNA |
| Lipofectamine LTX | Invitrogen | 15338-100 | used to transfect DNA |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668030 | used to transfect siRNA plus DNA |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Fetal Bovine Serum | Eurobio | CVFSVF0001 | |
| Cell strainer | Corning | 21008-949 | |
| Fluorodishes | World precision instruments | FD35-100 | dishes used to cultivate cells for live imaging |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 16% PFA (Paraformaldehyde) | Science Services GmbH | E15710 | |
| Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| BSA (Bovine Serum Albumine) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Saponine | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | use at 200ng/ul |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and Media | |||
| Digestion Mix | in DPBS 5 mg/ml collagenase 3.5 mg/ml dispase sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 °C |
||
| Dissection Medium | in IMDM Glutamax supplemented 10% FBS 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
| Growth Medium | in IMDM Glutamax supplemented 20% FBS 1% Chicken Embryo Extract 1% Penicillin-Streptomycin1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
| Differentiation Medium | in IMDM Glutamax supplemented 2% Horse Serum 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
| Blocking Solution | in DPBS 10% Goat Serum 5% BSA add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).
- Manring, H., Abreu, E., Brotto, L., Weisleder, N., Brotto, M. Novel excitation-contraction coupling related genes reveal aspects of muscle weakness beyond atrophy-new hopes for treatment of musculoskeletal diseases. Front Physiol. 5, 37 (2014).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. J Vis Exp. (73), (2013).
- Meng, H., Janssen, P. M. L., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Demonbreun, A. R., McNally, E. M. DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers. J Vis Exp. (106), (2015).
- Falcone, S., Roman, W., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Mol Med. 6 (11), 1455-1475 (2014).
- Flucher, B. E., Phillips, J. L., Powell, J. A. Dihydropyridine receptor alpha subunits in normal and dysgenic muscle in vitro: expression of alpha 1 is required for proper targeting and distribution of alpha 2. J Cell Biol. 115 (5), 1345-1356 (1991).
- Cooper, S. T., Maxwell, A. L., et al. C2C12 co-culture on a fibroblast substratum enables sustained survival of contractile, highly differentiated myotubes with peripheral nuclei and adult fast myosin expression. Cell Motil Cytoskeleton. 58 (3), 200-211 (2004).
- Al-Qusairi, L., Laporte, J. T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases. Skelet Muscle. 1, 26 (2011).
- Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. A system to study mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance. Development. , (2016).
- Vilmont, V., Cadot, B., Vezin, E., Le Grand, F., Gomes, E. R. Dynein disruption perturbs post-synaptic components and contributes to impaired MuSK clustering at the NMJ: implication in ALS. Sci Rep. 6, 27804 (2016).
