基于形态学度量大规模重建和独立，公正聚类分类神经元选择性人群
Summary
这个协议描述以下具有修饰的狂犬病毒表达荧光标记物，以及独立的，公正的聚类分析，使不同的神经元亚类之间的形态度量的全面表征逆行感染选择性神经元群体的大规模重建，进行标记。
Abstract
该协议概述了神经元与使用独立，公正的集群相结合的大规模重建分析创建的选择性神经人口中观察到的形态特征进行全面的调查。这些技术的组合构成用于神经解剖学数据的收集和分析的新方法。总之，这些技术使大规模，和选择性的神经元群体的因此更全面，取样和建立用于说明人口内形态学独特神经类偏定量方法。
该协议概述了采用改性狂犬病毒的选择性标记神经元。 G-删除以下立体定位注射到感兴趣的目标大脑结构的狂犬病毒的作用就像一个逆行示踪剂，并作为EGFP的神经元递送和表达的载体。神经元大量地使用这个感染技术，并表示在他们的树突GFP，生产“高尔基样”单个神经元的完整罢了。因此，病毒介导的逆行追踪方法，通过生产完整的细胞内填充在传统的基于染料逆行追踪技术改进。
个体以及隔离神经元跨越所研究的大脑区域的所有区域，以获得的神经元的一个代表性的样品被选择用于重建。该协议概述了程序，以重建胞体和完成标记细胞跨越多个组织切片的树突分支模式。形态数据，包括脑结构中的每个神经元的位置，提取用于进一步分析。标准编程功能被用于执行独立的聚类分析和基于形态学指标群的评价。为了验证这些分析的聚类分析PERFO的效用，统计评估Rmed指对在猕猴丘脑（TRN）的丘脑网状核重建神经元160制成。无论是原聚类分析和这里执行的统计评价表明TRN神经元被分为三个亚群，每个具有独特形态特征。
Introduction
神经解剖学处于“连接组学”神经科学1和近期利益的基础之一续签了解神经元群体的形态多样性和特殊的神经元2之间的连接热情。用于标记的方法和重建神经元与最近的创新，包括遗传性和病毒介导的电路跟踪有很大的提高接近3，4，使神经元群体5的更全面的形态的调查。除了在标记单个神经元的改进，定量数据分析技术也已出现，使神经元的独立的和无偏分类成基于形态学数据5，6个不同亚群。这些偏见的技术是在更多的繁体版的改进升定性分类方法已经在该领域的标准了一个多世纪。这项研究的目的是概述，一步一步，选择性群体内神经元的病毒介导的标记的组合，这些神经元的综合样本，和定量数据分析的大规模重建基于与独立聚类统计评估。通过结合这些方法，我们概述朝向收集和神经解剖学数据的分析的新方法，以促进选择性的神经元群体中全面采样和形态学独特神经类型的无偏分类。
由于这些方法的一个例子，我们描述了猕猴的丘脑网状核（TRN）的单个扇区内我国人口众多的神经元进行分析。这些数据是从以前的研究7。用于选择性地标记TRN神经元投射到背latera方法采用手术注射编码EGFP 4,8修改狂犬病毒的丘脑（dLGN）l的膝状体（ 具体见材料/设备 ，第2行的表 ）进行了概述。本变形狂犬病毒缺乏基因编码的基本外壳蛋白，消除了病毒的跨突触运动。一旦病毒在注射部位进入轴突终端，它的作用就像与驱动整个感染神经元5，9，10的全树突分支EGFP表达的重要的益处传统逆行示踪剂。因此，该G-删除狂犬病毒可被用于选择性地感染和标签以下注射和逆行运输任何神经元群体。
为了执行特定的神经元群的综合分析，它从采样是重要神经元的人口中的广泛分布。由于病毒介导的标记技术产生完整的细胞内，“高尔基样”与在病毒注射部位轴突许多神经元的填充，是可能的一个大脑结构的全部范围内重建神经元的一个非常大的样品。此外，由于改性狂犬病毒是在感染和标签大量的神经元，以便有效的，但是可能重建数百每只动物的神经元。为为了生成dLGN投射TRN神经元的全面样品取样160的神经元在整个TRN 11的视觉扇区程序进行了概述。描述重建使用神经重建系统包括显微镜，照相机，和重建软件单个神经元的过程。还描述了方法来确定大脑结构中（TRN在中在这种情况下）单个神经元的位置，并核实病毒注射坐使用体积轮廓重建一个结构（在dLGN内这种情况下）内È体积和位置。步骤导出形态学数据和执行独立的聚类分析的基础上对每个神经元的形态测量指标进行了概述。有对聚类方法的限制，也有可用的多种不同的聚类算法。因此，这些选项和的一些更常用算法的优点进行说明。聚类分析不提供集群的唯一性的统计验证。因此，额外的步骤概述，以验证最佳聚类以及内和跨集群形态学数据之间的关系。用于评价集群的TRN数据集，以确认TRN神经元的统计方法被分组为基于被描述10独立形态度量三个独特簇。
因此，通过概述用于选择性标记步骤，重构，并从一个特定的神经元群体分析形态学数据，我们描述用于定量群体内的神经元之间的形态差异的方法。猕猴TRN视觉部门不同的神经元类型的此前的研究结果证实，独立的统计评价方法。总之，我们希望这些技术将广泛适用于神经解剖数据集，并有助于通过建立大脑的神经元群体的多样性量化分级。
Protocol
Representative Results
Discussion
神经解剖学研究已经保持神经和连接组学和结构与功能的关系近期备受关注的支柱已经更新了选择性神经元群的详细的形态学特征热情。传统上，神经解剖学研究依赖于神经元的定性分类成形态不同的类专家neuroanatomists定义的神经元。在所述技术用于重建神经元和提取形态学数据的进步，现在可以利用更复杂的和定量的数据分析方法，形态不同的神经元类无偏方式进行分类。在这项研究中，一步?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们想感谢博士。埃德卡拉威和马蒂Usrey允许我们使用的预先研究和利比Fairless和柿园刘与神经重建帮助的一部分准备的组织。和白厅基金：这项工作是由美国国立卫生研究院（NEI EY018683）资助。
Materials
| SADΔG-EGFP | E.M. Callaway Laboratory, Salk Institute | Prepared by Dr. F. Osakada. G-deleted rabies virus available through the Salk Institute Viral Core | |
| Recording electrode: platinum/iridium or tungsten | FHC | UEPSGGSE1N2M | Visit website (www.fh-co.com) for alternative order specifications |
| Nanoject II | Drummod Scientific | 3-000-204, 110V | Alternatives: picospritzer, Hamilton syringe |
| Freezing microtome | Thermo Scientific | ||
| DAB | Sigma Aldrich | D5905-50TAB | 3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride, tablet, 10 mg substrate per tablet. Caution: carcinogen – must be bleached before discarding |
| Cytochrome C | Sigma Aldrich | C2037-100MG | |
| Catalase | Sigma-Aldich | C9322-5G | |
| Rabbit anti-GFP | Life Technologies/Thermo Fisher | #A-11122 | Primary antibody |
| Biotinylated goat anti-rabbit | Vector Laboratories | #BA-1000 | Secondary antibody |
| Neurolucida System | MicroBrightField | Software for neuron tracing and analysis. http://www.mbfbioscience.com/neurolucida | |
| Neurolucida Explorer | MicroBrightField | Data export software | |
| Microfire Camera | Optronics | 2-Megapixel true color microscope camera. http://www.simicroscopes.com/pdfs/microfire.pdf | |
| Nikon E800 Microscope | Nikon Instruments Inc. | Biological research microscope. http://www.microscopyu.com/museum/eclipseE800.html | |
| Matlab | The MathWorks Inc. | Matrix-based computational mathematics software. http://www.mathworks.com | |
| Microsoft Office Excel | Microsoft | Spreadsheet program |
References
- Cajal, S. R. y. . Histologie du systeme nerveaux de l’homme et des vertebres. , (1911).
- Seung, H. S. Toward functional connectomics. Nature. 471, 170-172 (2011).
- Callaway, E. M. Transneuronal circuit tracing with neurotropic viruses. Current Opinion in Neurobiology. 18, 1-7 (2009).
- Wickersham, I. R., Finke, S., Conzelmann, K. K., Callaway, E. M. Retrograde neuronal tracing with a deletion-mutant rabies virus. Nature Methods. 4, 47-49 (2007).
- Briggs, F., Kiley, C. W., Callaway, E. M., Usrey, W. M. Morphological substrates for parallel streams of corticogeniculate feedback originating in both V1 and V2 of the macaque monkey. Neuron. 90, 388-399 (2016).
- Cauli, B., et al. Classification of fusiform neocortical interneurons based on unsupervised clustering. PNAS. 97, 6144-6149 (2000).
- Bragg, E. M., Fairless, E. A., Liu, S., Briggs, F. Morphology of visual sector thalamic reticular neurons in the macaque monkey sugests retinotopically-specialized, parallel stream-mixed input to the lateral geniculate nucleus. J. Comparative Neurology. 525 (5), 1273-1290 (2017).
- Osakada, F., et al. New rabies virus varients for monitoring and manipulating activity and gene expression in defined neural circuits. Neuron. 71, 617-631 (2011).
- Callaway, E. M., Luo, L. Monosynaptic circuit tracing with glycoprotein-deleted rabies viruses. Journal of Neuroscience. 35, 8979-8985 (2015).
- Nhan, H. L., Callaway, E. M. Morphology of superior colliculus- and middle temporal area-projecting neurons in primate primary visual cortex. J. Comparative Neurology. 520, 52-80 (2012).
- Pinault, D. The thalamic reticular nucleus: structure, function and concept. Brain Research Reviews. 46, 1-31 (2004).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. 65, e3564 (2012).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Research. 171, 11-28 (1979).
- Gerfen, C. R. Basic neuroanatomical methods. Current Protocols in Neuroscience. Chapter 1, Unit 1.1 (2003).
- Thorndike, R. L. Who belongs in the family?. Psychometrika. 18, 267-276 (1953).
- Talebi, V., Baker, C. I. Categorically distinct types of receptive fields in early visual cortex. Journal of Neurophysiology. 115, 2556-2576 (2016).
- Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500, 168-174 (2013).
